生物電鏡樣本制備技術(shù)，看完就會(huì)

現(xiàn)如今，電鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用越來(lái)越頻繁，電鏡在揭示生物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系上起到重要作用。近年來(lái)，電鏡技術(shù)的普及使其在SCI論文中出場(chǎng)率越來(lái)越高。

那么，一張漂亮的電鏡圖該怎么得到呢？

重中之重當(dāng)然是樣本制備了，

今兒，我就針對(duì)“電鏡樣本制備”作一簡(jiǎn)單的介紹。

1　電鏡簡(jiǎn)介

1665年，Robert Hoek制作出世界上第一臺(tái)光學(xué)顯微鏡，開(kāi)啟了生物醫(yī)學(xué)研究的微觀時(shí)代。人眼的分辨率最大為0.2mm（1mm=10^6nm），光學(xué)顯微鏡的分辨率為200nm。

但是后來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡已經(jīng)不注意幫助我們觀察世界了。于是，近300年后的1932年，電鏡之父E.Ruska發(fā)明了世界上第一臺(tái)透射電子顯微鏡，將人類(lèi)帶入超微世界。電鏡分辨率約為0.2nm。

電子顯微鏡的工作原理是利用電磁透鏡產(chǎn)生的磁場(chǎng)或電場(chǎng)折射電子束，然后通過(guò)電子束轟擊熒光屏，激發(fā)熒光而成像。

發(fā)展至今，電鏡已經(jīng)衍生出多種其它的運(yùn)用，如冷凍蝕刻、電鏡酶化學(xué)、免疫電鏡、電鏡自顯影、電鏡3D重構(gòu)等等，這些都大大增加了電鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用范圍。甚至，部分腫瘤的診斷也依賴(lài)于電鏡照片。但是電鏡也不是完美的，電鏡觀察的視野太小，必須有光鏡觀察結(jié)果輔助，就是說(shuō)，電鏡+光鏡是標(biāo)配。

無(wú)論電鏡的應(yīng)用如何衍生發(fā)展，電鏡生物樣本的取材和制備依然是重中之重。

2　電鏡樣本采集

電鏡樣本制備大致可分為8步：取材→前固定(戊二醛)→后固定(鋨酸)→脫水→浸透→包埋→切片→重金屬電子染色。

電鏡取材要求：

（1）組織取材:

切除組織要快，1min內(nèi)即要浸入電鏡前固定液(戊二醛必須要提前預(yù)冷至4℃)。組織塊大小一般1.0mm*1.0mm*1.0mm，允許切成2×1×1mm長(zhǎng)形小條，用以區(qū)分組織方向，但是觀察面需與長(zhǎng)軸垂直。選擇部位準(zhǔn)確無(wú)誤，無(wú)關(guān)部分必須切去。全程操作需保持在0-4℃的環(huán)境中，防止組織自溶。

在此，我“墻裂”建議指派課題組內(nèi)心靈手巧的女孩子做組織取材工作，杜絕手殘黨（逃......）

3　組織塊取材注意事項(xiàng)：

①取材器械必須鋒利，切勿牽拉、擠壓組織塊。

②如果取材樣本數(shù)量較少，那么小編建議你可以將取出的組織塊放在潔凈的卡片紙上，滴一滴4℃的前固定液在上面然后快速修塊（萬(wàn)不可直接修塊，因?yàn)樾K組織非常容易干燥且受到周?chē)h(huán)境影響）。

③如果你需要取材組織很多，來(lái)不及現(xiàn)場(chǎng)修塊。我建議你可以取材時(shí)先取適宜的大塊浸入前固定液固定后1小時(shí)后再修塊。（萬(wàn)不可現(xiàn)場(chǎng)強(qiáng)行修塊，等你修好了，組織細(xì)胞也差不多自溶了。）

④特別復(fù)雜的結(jié)構(gòu)需原位灌注固定后取材。若涉及骨組織取材，首選需脫鈣處理，常規(guī)脫鈣即可。

（2）貼壁細(xì)胞：

培養(yǎng)液倒掉；加入預(yù)冷至4℃的前固定液，固定15min；用細(xì)胞刮子輕輕將將細(xì)胞刮下；以2000-3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，使細(xì)胞在離心管底部的尖端沉淀結(jié)塊。

（3）懸浮細(xì)胞：

加入等量預(yù)冷至4℃的前固定液，固定30min；以1000轉(zhuǎn)/min離心5min使細(xì)胞沉淀；把上清液吸掉；再加入預(yù)冷至4℃的前固定液，固定30min；以2000-3000轉(zhuǎn)/min離心15min，使細(xì)胞沉淀結(jié)塊。

可以看出，細(xì)胞的電鏡制備也是將細(xì)胞制備成組織塊的樣子，因此后期的過(guò)程可大致將其視為組織塊處理。

4　電鏡樣本固定

電鏡樣本固定分為前固定和后固定。

（1）戊二醛前固定

戊二醛（C5H8O2）的穿透性強(qiáng)，能夠較好的保存微細(xì)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)時(shí)間（如1-2月）的戊二醛固定對(duì)于電鏡組織樣本影響不大。但戊二醛對(duì)組織抗原有一定影響，戊二醛還無(wú)法保存脂肪組織，并且戊二醛對(duì)細(xì)胞膜的顯示顯示效果不好。

一般來(lái)說(shuō)，戊二醛PH為4.0-5.0。我建議用之前可以拿PH試紙或PH計(jì)測(cè)一下，如果戊二醛的PH降到3.5以下，則堅(jiān)決棄用。平時(shí)放在4℃冰箱保存即可。

前固定一般采用2%-4%戊二醛固定1-2小時(shí)即可，配制后的PH溶液PH應(yīng)該在7.3-7.4之間，固定前必須要預(yù)冷至4℃，戊二醛使用體積：組織塊體積約40:1即可。

（2）磷酸鹽緩沖液漂洗

漂洗時(shí)在4℃環(huán)境下，磷酸鹽緩沖液漂洗0.4-2小時(shí)即可，中間需換液2次。

這里我介紹2種漂洗緩沖液，都可以用。

①：0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（可用于配制戊二醛溶液）

甲液：Na2HPO4 · 2H2O 35.61g加雙蒸水定容到1000ml

乙液：NaH2PO4 · H2O 27.60g加雙蒸水定容到1000ml

②：Milloning磷酸鹽緩沖液（后面可再次用于配制鋨酸）

甲液：2.26% NaH2PO4 · H2O 水溶液

乙液：2.25%NaOH水溶液

丙液：5.4%葡萄糖水溶液

丁液：41.5ml甲液+8.5ml乙液

終液：5ml丙液+45ml丁液，PH為7.3。

（3）鋨酸后固定

鋨酸的滲透性較弱，每小時(shí)僅滲透0.1-0.3mm的組織，一般需要固定2小時(shí)。千萬(wàn)不要過(guò)久地固定，因?yàn)殇~酸可以使得組織變得很硬。鋨酸在受熱和見(jiàn)光時(shí)極易分解，同時(shí)鋨酸中還含有葡萄糖，該液易變質(zhì)，所以需要現(xiàn)用現(xiàn)配，不可長(zhǎng)期儲(chǔ)備。

市售的鋨酸配制時(shí)一般為2%。但是鋨酸固定一般選用1%濃度，在4℃環(huán)境中固定1-2小時(shí)，PH為7.3-7.4。鋨酸固定后也要用緩沖液漂洗至少20min，才能進(jìn)入脫水環(huán)節(jié)。

鋨酸固定液配制方法：2%鋨酸固定液5ml+10.8%葡萄糖0.5ml+Miilloning緩沖液4.5ml。配制后放置在4℃，避光，密封，2天以上才能完全溶解。如果鋨酸變色，那就不要再用了。

對(duì)了，還有很重要的一點(diǎn)，配制過(guò)程全程所有試劑千萬(wàn)不要接觸金屬。

5　電鏡樣本脫水

電鏡樣本脫水可選用乙醇或丙酮。

（1）50%乙醇或丙酮，脫水15min；

（2）70%乙醇或丙酮，脫水15min；

（3）80%乙醇或丙酮，脫水15min；

（4）90%乙醇或丙酮，脫水15min；

（5）100%乙醇或丙酮，脫水20-30min；

脫水的第一步比較重要，我建議從低濃度的50%乙醇或丙酮開(kāi)始。有的朋友可能因?yàn)橼s時(shí)間，直接從高濃度70%或者80%開(kāi)始。這樣其實(shí)不好，因?yàn)橹敖M織樣本處在一個(gè)水合環(huán)境下，如果突然進(jìn)入高濃度的脫水液會(huì)導(dǎo)致組織快速脫水，組織塊收縮嚴(yán)重，極易影響組織中超微結(jié)構(gòu)的原位，個(gè)人這一點(diǎn)很重要。

電鏡樣本浸透與包埋

電鏡樣本浸透與包埋可不是用石蠟喲，而是使用環(huán)氧樹(shù)脂+硬化劑。這一點(diǎn)大家可以自行選擇市售的即可。需要注意的是，環(huán)氧樹(shù)脂在冬天和夏天浸透與硬化的速度有些許區(qū)別，大家可適當(dāng)調(diào)整環(huán)氧樹(shù)脂+硬化劑的比例。我建議大家將冬夏兩季的試劑區(qū)分開(kāi)來(lái)使用。（全年恒溫土豪實(shí)驗(yàn)室可忽略此條。）

組織充分脫水后，先使用包埋劑浸透30min-數(shù)小時(shí)，然后再另用新的包埋劑浸透30min，最后包埋即可。

包埋時(shí)可使用配套的特定模具，如果沒(méi)有，可以找藥用的空心膠囊，將組織塊用牙簽轉(zhuǎn)移到膠囊底部，灌滿(mǎn)包埋劑后放到60℃烤箱中，烤24-36小時(shí)即可。梯度升溫可以，但是考慮到大家時(shí)間都很緊張，我就不介紹了。

6　電鏡樣本修塊和制片

電鏡樣本修塊沒(méi)啥特殊的。

大家知道削鉛筆吧，把膠囊削成該形狀，注意不要把組織給削沒(méi)了。電鏡組織切片要求為超薄片，一般為40-50nm。可以預(yù)先削出0.5-2μm的厚切片。

超薄切片可不是用載玻片承載的，而是配套的3mm直徑銅網(wǎng)，以便接受電子束的轟擊。

7　電鏡樣本染色

一般使用重金屬作為染色劑，常用的是醋酸鈾或者檸檬酸鉛。染色時(shí)既可以整塊組織染，也可以切片染，這都沒(méi)問(wèn)題。

介紹醋酸鈾染色方法。

常用濃度為2%-5%，用50%-70%乙醇或者丙酮配，還可以直接使用雙蒸水配制，二者使用條件不同。

（1）組織塊染色：當(dāng)組織脫水至70%乙醇或者丙酮時(shí)將組織70%乙醇或者丙酮配制的飽和醋酸鈾中，染色2.5小時(shí)或者放到冰箱中過(guò)夜染色也行。

（2）切片染色：找一個(gè)干凈的培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿上放一小塊干凈的石蠟塊。然后把染色液滴到石蠟上，將上一步制備好的超薄切片連同銅網(wǎng)一起，反扣在染色液上，保持20min。再用雙蒸水快速洗干凈。小編提醒，一定要將銅網(wǎng)洗干凈，否則時(shí)間久了銅網(wǎng)上溶液長(zhǎng)銅銹和結(jié)晶體，這樣搞不好得換銅網(wǎng)了。

基本上，關(guān)于電鏡樣本的制備過(guò)程大致如此。當(dāng)然，實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)。鑠思百檢測(cè)祝各位小伙伴實(shí)驗(yàn)順利哦。