分光光度法的基礎(chǔ)知識(shí)

分光光度法是基于測(cè)量溶液中物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收程度而建立起來(lái)的分析方法，主要包括比色法、紫外及可見(jiàn)分光光度法、紅外光譜法。那么，分光光度法困擾我們的最常見(jiàn)問(wèn)題是什么呢？

分光光度法的特點(diǎn)

有色物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性。它呈現(xiàn)的顏色與被吸收的光線(xiàn)的顏色互為補(bǔ)色，如果要確定某種溶液選擇吸收的特定波長(zhǎng)一般可以先用UV掃一下，確定最大波長(zhǎng)，也可以根據(jù)實(shí)際試樣通過(guò)查文獻(xiàn)來(lái)確定最大波長(zhǎng)。

表1 物質(zhì)的顏色和吸收顏色的關(guān)系

對(duì)任何一種有色溶劑，都可以測(cè)定出它的吸收光譜，UV的分光精度越高，作出的光吸收曲線(xiàn)的精度越高，光吸收程度最大處的波長(zhǎng)也就是最大吸收波長(zhǎng)。溶液濃度不同時(shí)，光吸收曲線(xiàn)的形狀相同，其最大吸收波長(zhǎng)不變，只是吸光度大小不同。我們?cè)跍y(cè)定時(shí)一般用最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。如圖1所示：不同濃度高錳酸鉀溶液的吸光度不同，但是最大吸收波長(zhǎng)都是在525nm。

圖1 不同濃度的高錳酸鉀溶液在400-650nm　波段的定性?huà)呙栉展庾V圖

另外，吸光度具有加合性，在某一入射波長(zhǎng)下，溶液中含有多種對(duì)光產(chǎn)生吸收的物質(zhì)，那么該溶液對(duì)該波長(zhǎng)光的吸光度A總應(yīng)等于溶液中每一種成分的吸光度之和。這一性質(zhì)對(duì)多組分的測(cè)定極為有利。

分光光度法的基本原理

ε用來(lái)衡量顯色反應(yīng)的靈敏度，ε越大則該反應(yīng)越靈敏。ε是有色化合物在一定波長(zhǎng)下的特征常數(shù)，它取決于有色化合物本身的性質(zhì)及其對(duì)光選擇吸收的能力，而與溶液的濃度和厚度無(wú)關(guān)。這也是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中選選顯色劑的依據(jù)。

朗波-比爾定律雖然是進(jìn)行定量分析的依據(jù)，但也是有一定的使用范圍的，有一些情況會(huì)使其失效，其適用范圍如圖2所示，導(dǎo)致朗波-比爾定律失效的原因如下：

(1)入射的光不是單色光。

比爾定律的前提就是入射光為單色光，但實(shí)際上現(xiàn)在所用的儀器很難做到純單色光，而一般得到的都是在一定波長(zhǎng)范圍的復(fù)合光。比較好的UV得到的單色光純度就會(huì)比較好，其所得的測(cè)量線(xiàn)的線(xiàn)性范圍就越寬，偏離比爾定律就比較小。

(2)由于化學(xué)變化引起的失效。

在進(jìn)行顯色反應(yīng)時(shí)，有時(shí)因?yàn)樾纬刹煌慕j(luò)合物，以及締合物的電離、溶劑化、互變異構(gòu)等現(xiàn)象的存在都會(huì)引起有色化合物濃度的變化，而使工作曲線(xiàn)發(fā)生彎曲變化。

(3)由于介質(zhì)的不均勻性而引起的失效。

一些小的企業(yè)實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)用到標(biāo)準(zhǔn)樣換算法，采用這種方法要注意的問(wèn)題是：

(1)工作曲線(xiàn)通過(guò)原點(diǎn)。

(2)工作曲線(xiàn)呈直線(xiàn)。

(3)試樣中待測(cè)組分的含量與標(biāo)準(zhǔn)樣品的含量相接近，且待測(cè)試樣的組成與標(biāo)準(zhǔn)樣品的組成相類(lèi)似。

顯色反應(yīng)及其影響因素

在實(shí)際試驗(yàn)中怎么處理溶液中共存離子的影響？

消除共存離子的途徑主要有以下幾個(gè)方法：

（1）利用掩蔽劑消除干擾。

（2）控制溶液的酸堿度。

（3）利用氧化還原反應(yīng)改變干擾離子的價(jià)態(tài)，也是消除干擾的有效辦法。

（4）控制顯色條件消除干擾。

（5）利用校正系數(shù)消除干擾。

（6）采用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法。

提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度需要怎樣的測(cè)試條件？

（1）選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)。

（2）選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤骸Ｍǔ＠梅止夤舛扔?jì)透光率為100%作為測(cè)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的溶液叫做參比溶液。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中的參比要人如何選擇？

（4）褪色空白。

當(dāng)試樣基體有顏色，顯色劑也有顏色，單一使用試樣空白或者試劑空白都不可行，在此情況下，如能尋找到一種褪色劑，有選擇性的將被測(cè)離子絡(luò)合或改變它的價(jià)態(tài)，使顯色的有色物質(zhì)褪色，以此來(lái)作為參比溶液，可同時(shí)消除有色試劑和有色共存離子的干擾。

不顯色空白。有些顯色反應(yīng)，當(dāng)所用試劑的加入順序發(fā)生變化時(shí)就不會(huì)顯色，這樣配制的空白溶液含有試樣基體和試劑的顏色，但被測(cè)離子有沒(méi)有顯色，簡(jiǎn)稱(chēng)為不顯色空白。可消除試樣溶液顏色的干擾。

（5）平行操作空白。

在微量或精確分析中，為了消除所用試劑顏色的影響以及在操作過(guò)程中可能引入的極微量被測(cè)離子的影響，可用不含被測(cè)離子的試樣或不稱(chēng)樣，其余的和正常測(cè)樣的試驗(yàn)流程一樣操作，簡(jiǎn)稱(chēng)平行操作空白。

（6）控制適當(dāng)?shù)奈舛榷葦?shù)范圍。

從圖2可以看出在A=0.434時(shí)光度誤差最小，透光度在20%-65%讀數(shù)，其光度誤差是比較小的。因此為了控制適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)讀數(shù)（吸光度在0.2-0.8），在實(shí)際工作中，可根據(jù)待測(cè)組分濃度的高低，選擇合適的稱(chēng)樣量、稀釋倍數(shù)、顯色體積以及比色皿的厚度等，來(lái)控制有色溶液的吸光度讀數(shù)。

圖2.光度誤差與吸光率的關(guān)系圖

圖3.參比液的選擇原則

分光光度計(jì)

分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)都是由光源、分光系統(tǒng)、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量信號(hào)顯示系統(tǒng)5個(gè)基本部分組成。一般有雙光束和單光束兩種類(lèi)型。

分光光度計(jì)的一般檢測(cè)項(xiàng)：