色譜法是實(shí)驗(yàn)室非常重要又常用的分析方法，由于色譜分析可以連續(xù)對(duì)樣品進(jìn)行濃縮、分離、提純及測(cè)定，使其成為每一個(gè)分析工作者普遍采用的分析、檢測(cè)手段，并已廣泛應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)中，可以說(shuō)只要有分析任務(wù)的地方都在使用色譜分析法。今天咱們補(bǔ)充基礎(chǔ)知識(shí)哦。

色譜法的創(chuàng)始人是俄國(guó)的植物學(xué)家茨維特（ M.Tswett）。1906年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特發(fā)表了他的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：為了分離植物色素，他將含有植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同，隨著淋洗的進(jìn)行，不同色素向下移動(dòng)的速度不同，從而形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了分離。他將這種分離方法命名為色譜法(chromatography)。

偉大的茨維特

植物葉色素的分離實(shí)驗(yàn)

? 茨維特實(shí)驗(yàn)圖示

√ 色譜柱—玻璃柱

√ 固定相—CaCO3顆粒

√ 流動(dòng)相—石油醚

隨著分離手段的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的無(wú)色物質(zhì)成為被分離的對(duì)象，色譜也漸漸失去了“色”的含義，但這個(gè)名稱卻沿用至今。

色譜分析法（Chromatography）簡(jiǎn)稱色譜法或?qū)游龇?，是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法，該法利用某一特定的色譜系統(tǒng)（薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統(tǒng)）進(jìn)行混合物中各組分的分離分析，主要用于分析多組分樣品。

? 固定相：在色譜分離中固定不動(dòng)，對(duì)樣品產(chǎn)生保留的一相。

? 流動(dòng)相：帶動(dòng)樣品向前移動(dòng)的另一相。

分類

1、按兩相物理狀態(tài)分類

? 流動(dòng)相：氣相色譜、液相色譜、超臨界流體色譜

? 固定相：氣－固、氣－液；液－固、液－液

2、按固定相的形式分類

? 柱色譜：填充柱色譜、毛細(xì)管柱色譜、微填充柱色譜、制備色譜

? 平面色譜：紙色譜、薄層色譜、高分子膜色譜

3、按分離機(jī)制分類

? 吸附色譜：根據(jù)不同組分在吸附劑上的吸附和解吸能力的大小而分離

? 分配色譜：根據(jù)不同組分在固定液中溶解度的大小而分離

? 分子排阻色譜：依據(jù)分子體積大小不同進(jìn)行分離ln離子交換色譜：不同組分對(duì)離子交換樹(shù)脂的親和力不同而分離

? 親和色譜：利用生物大分子之間的存在的專一的特殊親和力進(jìn)行分離

? 毛細(xì)管電泳：依據(jù)各組分淌度和（或）分配行為的差異進(jìn)行分離

? 手性色譜：用于手性藥物的分離分析，可分為三類：手性衍生化試劑法；手性流動(dòng)相添加劑法；手性固定相拆分法

基本術(shù)語(yǔ)

1、色譜法的基本術(shù)語(yǔ)

檢測(cè)色譜分離后組分的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間作圖得到的曲線稱為色譜圖。

色譜流出曲線

? 基線：在一定色譜條件下，僅有流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的信號(hào)的曲線，稱為基線，如圖中ot線。實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定時(shí)，基線是一條平行于橫軸的線；基線反映儀器（主要是檢測(cè)器）的噪聲隨時(shí)間的變化。

? 峰高：色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖AB’線。

? 區(qū)域?qū)挾?/span>：色譜峰的區(qū)域?qū)挾戎苯优c分離效率有關(guān)。描述色譜峰寬的方法有三種：標(biāo)準(zhǔn)偏差σ、峰寬W、半峰寬W1/2。

? 標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ）：σ為正態(tài)分布曲線上兩拐點(diǎn)間距離之半，σ值的大小表示組分離開(kāi)色譜柱的分散程度。σ值越大，流出的組分越分散，分離效果變差；反之，流出組分集中，分離效果好。

? 峰寬W：通過(guò)色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線，在基線上的截距稱為峰寬，或稱基線寬度，也可用W表示，如圖IJ 的距離。根據(jù)正態(tài)分布的原理 ，可證得峰寬和標(biāo)準(zhǔn)差的關(guān)系是W=4σ。

? 半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬稱為半峰寬，如圖 GH 的距離。W1/2=2.355σ，W=1.699W1/2。

W1/2、W都是由σ派生而來(lái)的，除用它們衡量柱效外，還用于計(jì)算峰面積。半峰寬測(cè)量較方便，最為常用。

2、色譜保留值、相對(duì)保留值與保留指數(shù)

? 保留值

是用來(lái)描述樣品組分在色譜柱中保留程度的參數(shù)，并作為色譜定性的指標(biāo)。其表示方法有：

? 相對(duì)保留值

又稱分離因子、分配系數(shù)比或相對(duì)容量因子，即在一定色譜條件下，被測(cè)組分的調(diào)整保留時(shí)間（體積）與標(biāo)準(zhǔn)物的調(diào)整保留時(shí)間（體積）之比。

采用相對(duì)保留值是為了消除某些操作條件，如流速和固定液流失等，對(duì)保留值的影響。相對(duì)保留值中標(biāo)準(zhǔn)物可以是被測(cè)樣品中的某一組分，也可以是人為加入的某一化合物。

? 保留指數(shù)

I為待測(cè)物質(zhì)i在某固定液X上的保留指數(shù)，選取兩個(gè)正構(gòu)烷烴作為基準(zhǔn)物質(zhì)，其中一個(gè)的碳數(shù)為N，另一個(gè)為N+n，它們的調(diào)整保留時(shí)間分別為t’R(N)和 t’R(N+n)，使待測(cè)物質(zhì)i的調(diào)整保留時(shí)間t’R(i)恰好于兩者之間，即t’R(N)<t’R(i)<t’R(N+n)。將含物質(zhì)i和所選的兩個(gè)正構(gòu)烷烴的混合物注入其固定液X的色譜柱，在一定溫度條件下繪制色譜圖。

保留指數(shù)的計(jì)算式為：

當(dāng)相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷的碳數(shù)差值n=1時(shí)，保留指數(shù)或簡(jiǎn)化為：

3、容量因子與分配系數(shù)

（1）容量因子（k）

在平衡狀態(tài)下，組分在固定相(s)與流動(dòng)相(m)中的質(zhì)量之比，稱為容量因子。公式如下：

（2）分配系數(shù)（K）

在平衡狀態(tài)下，組分在固定相(s)與流動(dòng)相(m)中的濃度之比，稱為分配系數(shù)。公式如下：

? K與k的關(guān)系：

? 保留值與容量因子及分配系數(shù)的關(guān)系

色譜分離是基于固定相對(duì)試樣中各組分的吸附或溶解能力強(qiáng)弱的不同，而這種吸附或溶解能力的強(qiáng)弱可定量地用分配系數(shù)K（或容量因子k）值的大小來(lái)表示。吸附或溶解能力強(qiáng)的組分分配系數(shù)（或容量因子）大，保留時(shí)間長(zhǎng)；反之，吸附或溶解能力弱的組分分配系數(shù)小，保留時(shí)間短。

基本理論

主要包括塔板理論和速率理論。

1、塔板理論

（1）提出——熱力學(xué)理論

? 始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。

? 分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。

? 色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。

（2）假設(shè)

（1）色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)可以很快達(dá)到分配平衡。

（2）流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱，不是連續(xù)的而是脈動(dòng)式的，即每次通過(guò)為一個(gè)塔板體積。

（3）樣品加在每個(gè)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。

（4）在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無(wú)關(guān)。即分配系數(shù)在各塔坂上是常數(shù)。

（3）原理

塔板理論示意圖

? 開(kāi)始時(shí)，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的某組分加到第0號(hào)塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。

? 當(dāng)一個(gè)板體積（lΔV）的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0號(hào)板時(shí)，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂?shù)?號(hào)板上，此時(shí)0號(hào)板液相中ns部分組分及1號(hào)板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號(hào)板上所含組分總量為0.5，其中氣液兩相各為0.25而1號(hào)板上所含總量同樣為0.5．氣液相亦各為0.25。

? 以后每當(dāng)一個(gè)新的板體積載氣以脈動(dòng)式進(jìn)入色譜柱時(shí)，上述過(guò)程就重復(fù)一次(見(jiàn)下表)。

（4）色譜流出曲線方程

（5）色譜柱效參數(shù)

理解：在tR一定時(shí)，W或W1/2越小(即峰越窄)，理論板數(shù)n越大， 理論板高越小，柱的分離效率越高。有效理論塔板neff也同此理。因此，理論塔板數(shù)是評(píng)價(jià)柱效能的指標(biāo)。

（6）特點(diǎn)及不足

2、速率理論

1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來(lái)，提出了色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論——速率理論，導(dǎo)出了Van Deemter方程。它把色譜過(guò)程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過(guò)程，研究過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。

后來(lái)Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）。

（1）Van Deemter方程

（2） Giddings方程

定量與定性分析

（一）定性分析

色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標(biāo)。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。

但是不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專屬的。因此僅根據(jù)保留值對(duì)一個(gè)完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來(lái)源、性質(zhì)、分析目的的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品組成作初步的判斷，再結(jié)合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。

1、利用純物質(zhì)對(duì)照定性

在一定的色譜條件下，一個(gè)未知物只有一個(gè)確定的保留時(shí)間。因此將已知純物質(zhì)在相同的色譜條件下的保留時(shí)間與未知物的保留時(shí)間進(jìn)行比較，就可以定性鑒定未知物。若二者相同，則未知物可能是已知的純物質(zhì)；不同，則未知物就不是該純物質(zhì)。

純物質(zhì)對(duì)照法定性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡(jiǎn)單，且有純物質(zhì)的未知物。

2、相對(duì)保留值法

在某一固定相及柱溫下，分別測(cè)出組分i和基準(zhǔn)物質(zhì)s的調(diào)整保留值，再按上式計(jì)算即可。用已求出的相對(duì)保留值與文獻(xiàn)相應(yīng)值比較即可定性。

3、加入已知物增加峰高法

當(dāng)未知樣品中組分較多，所得色譜峰過(guò)密，用上述方法不易辨認(rèn)時(shí)，或僅作未知樣品指定項(xiàng)目分析時(shí)均可用此法。

首先作出未知樣品的色譜圖，然后在未知樣品加入某已知物，又得到一個(gè)色譜圖。峰高增加的組分即可能為這種已知物。

4、保留指數(shù)定性法

保留指數(shù)表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是目前GC中使用最廣泛并被國(guó)際上公認(rèn)的定性指標(biāo)。它具有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)。

保留指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實(shí)驗(yàn)條件無(wú)關(guān)。其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好。只要柱溫與固定相相同，就可應(yīng)用文獻(xiàn)值進(jìn)行鑒定，而不必用純物質(zhì)相對(duì)照。

（二）定量分析

1、峰面積測(cè)量方法

峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測(cè)量的準(zhǔn)確與否直接影響定量結(jié)果。對(duì)于不同峰形的色譜峰采用不同的測(cè)量方法。

2、定量校正因子

3、定量計(jì)算方法

（1）面積歸一化法

（2）外標(biāo)法

以待測(cè)組分純品為對(duì)照物，與試樣中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法。

（3）內(nèi)標(biāo)法

所謂內(nèi)標(biāo)法，是將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加入到待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中，再進(jìn)行分析測(cè)定的方法。

（4）標(biāo)準(zhǔn)加入法