纖維二糖酶在不同pH下的拉曼光譜分析

拉曼光譜是一種散射光譜，目前已廣泛應(yīng)用于材料、化工、石油、高分子、生物、環(huán)保、地質(zhì)等領(lǐng)域。拉曼光譜是研究分子振動的一種光譜方法，它可以提供關(guān)于分子內(nèi)部各種簡正振動頻率及有關(guān)振動能級的情況，從而可以用來鑒定分子中存在的官能團。它的譜線強度取決于相應(yīng)的簡正振動過程中極化率變化的大小。

　　蛋白質(zhì)受外界因素如溫度、pH、紫外輻射等影響而發(fā)生構(gòu)象變化，即分子內(nèi)部原有的高度規(guī)則性的空間排列和折迭方式發(fā)生變化，致使原物理、化學(xué)、生物性質(zhì)部分或全部喪失。目前，在蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中，特別是溶液中蛋白質(zhì)大分子空間結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的動態(tài)研究中，激光拉曼光譜已成為很有前景的新技術(shù)。從蛋白質(zhì)的拉曼光譜可以得到有關(guān)它的芳香族組成氨基酸的信息，還能進一步得到二級結(jié)構(gòu)的信息。有關(guān)利用拉曼光譜分析多肽及蛋白質(zhì)構(gòu)型的研究國內(nèi)外均有報道。Ellepola等吲研究了大米球蛋白在各種處理方式下拉曼光譜的變化。周殿鳳等利用拉曼光譜分析、研究了紫外輻射對牛血清白蛋白影響。余多慰等對綠色木霉(Trichoderma viride)纖維素酶中的CBH 11(Cel—lobiohydrolaseⅡ)在固態(tài)以及兩種pH的液態(tài)中酶分子的側(cè)鏈構(gòu)象與側(cè)鏈環(huán)境狀態(tài)進行了拉曼分析，揭示了活性中心酪氨酸的作用。

　　本實驗室在綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵過程中，觀察到纖維二糖酶(Cellobiase，CB)受pH的影響顯著，是限制纖維素水解的重要因素。為此，本文采用拉曼光譜分析了纖維二糖酶經(jīng)不同pH處理后蛋白構(gòu)象的變化，并對其主要的碳鏈與側(cè)鏈構(gòu)象進行研究。

1 材料與方法

1．1材料和儀器

　　采用本實驗室分離得到的纖維二糖酶(由綠色木霉產(chǎn)生)，濃度為0．1 g／L。激光顯微拉曼光譜儀(invia+Reflex)，英國Renishaw公司生產(chǎn)。

1．2實驗方法

　　取酶液，用HCl調(diào)節(jié)pH為5．0和2．0，測定纖維二糖酶酶活。酶活測定按文獻(xiàn)[6]進行。另取酶液在室溫(22℃)進行拉曼光譜分析。激發(fā)光波長785 nm，發(fā)射功率300 mW。每個樣品都重復(fù)掃描3次以上，各樣品的拉曼譜圖都由計算機作信號累加平均并繪圖輸出，峰位誤差小于±3cm-1

2　結(jié)果與討論

2．1 pH對纖維二糖酶酶活的影響

　　在pH 5．0和pH 2．0下測定纖維二糖酶酶活，將pH 2．0調(diào)回至5．0之后再測定酶活，以pH 5．0時測定酶活為100％。

　　纖維二糖酶在pH 2．0時酶活只有pH 5．0的1．0％，即使回調(diào)至pH 5．0之后，酶活也沒有恢復(fù)，說明在強酸性條件下，纖維二糖酶構(gòu)象上有所變化，致使酶活發(fā)生不可逆變化。為此對纖維二糖酶在pH 5．0和pH 2．0下進行拉曼光譜分析，考察其構(gòu)象變化。

2．2 pH對纖維二糖酶主鏈構(gòu)象的影響

　　pH 5．0和pH 2．0下纖維二糖酶的拉曼譜圖如圖1，其拉曼頻移和歸屬指認(rèn)見表1。

pH 5．0和pH 2．0下纖維二糖酶的拉曼譜圖

拉曼頻移和歸屬指認(rèn)

　　纖維二糖酶主鏈的構(gòu)象主要由酰胺I和酰胺Ⅲ的拉曼特征峰確定，酰胺I拉曼特征峰位置為：口-螺旋結(jié)構(gòu)：1 645--一1 660 em～；p折疊結(jié)構(gòu)：1 665"～1 680 emq,p-回折：1 680～1 690 em～；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)：1 660～1 670 cm～。酰胺Ⅲ拉曼特征峰位置為：儼螺旋結(jié)構(gòu)：1 265～1 300 cm～；p折疊結(jié)構(gòu)：1 230 1 240 cm～；p回折：1 305 cm～；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)：1 240 1 260 cm～?！趐H 5．0的纖維二糖酶溶液中，酰胺I譜帶出現(xiàn)在1 645 cm-1和1 666 am一，酰胺Ⅲ譜帶分別出現(xiàn)在1 240 cm_1和1 281 cm．‘。另外在890 cm_1出現(xiàn)了C—C伸縮振動吸收峰，1 063 cm．1和1 140cm-1出現(xiàn)了C—N伸縮振動峰，1 466 cm叫出現(xiàn)了C—H伸縮振動峰。由此表明，在pH 5．0溶液中的纖維二糖酶主要含有a一螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

　　在pH 2．0的纖維二糖酶溶液中，酰胺I譜帶出現(xiàn)在1 658 cm～，酰胺Ⅲ譜帶出現(xiàn)在1 288 cm～。而在pH 5．0時出現(xiàn)的酰胺I譜帶1 666 cm-1和酰胺Ⅲ譜帶1 240 cm_1并沒有很強的吸收峰。這兩個譜帶正是無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對應(yīng)的譜帶，說明在pH 2．0的時候，纖維二糖酶中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)被破壞了。另外在889 ClTI_1出現(xiàn)了C—C伸縮振動吸收峰，1 126 cm_1出現(xiàn)的C—N伸縮振動峰和1 476 cm叫出現(xiàn)了C—H伸縮振動峰，都與pH 5．0時峰位置有所不同，而且峰強也有所下降。由此表明，在pH2．0的纖維二糖酶溶液中主要含有口一螺旋結(jié)構(gòu)。pH從5．0到2．0的變化使纖維二糖酶的結(jié)構(gòu)中的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)受到很大影響，口一螺旋結(jié)構(gòu)也受到一定影響，酶構(gòu)象變化，穩(wěn)定性下降。

2．3 pH對纖維二糖酶側(cè)鏈環(huán)境的影響

　　蛋白質(zhì)某些殘基的側(cè)鏈拉曼光譜對環(huán)境變化敏感。由酪氨酸對羥苯基環(huán)的呼吸振動和環(huán)平面外彎曲振動的倍頻之間的費米共振引起的850 cm叫和830 cm_1左右的特征峰是構(gòu)象靈敏的譜線[7]，隨側(cè)鏈微環(huán)境而變化。當(dāng)強度比J。。。／J啪≥1時，該酪氨酸是“暴露的”；J啪／J啪<1時，該酪氨酸則是“埋藏的”。在pH 5．0時其峰位為834 cm-1和851 cm～，而在851 cm．1的峰強明顯低于834 cm．1的峰強，可得Jsso／is。o<1；而在pH 2．0時其峰位為833 cm．1和843 cm～，而在843 ca2_1的峰強明顯高于833Ca2-1的峰強，可得J啪／f啪≥1。由此可知，纖維二糖酶溶液在pH 5．0時酪氨酸為“埋藏式”，當(dāng)pH2．O時為“暴露式”。在色氨酸殘基的一系列譜帶中，1 361 cm-1譜帶對于環(huán)境和聚集狀態(tài)的改變是敏感的。當(dāng)色氨酸殘基的吲哚環(huán)處于“埋藏式”時，該譜線呈尖銳的峰形。在pH 5．0的纖維二糖酶溶液中，其峰位為570，1 364，1 556和1 620 cm_1；在pH 2．0的纖維二糖酶溶液中，其峰位為571，1 361，1 557和1 617 cm～。1 364 cm_1的峰強比1 361 cm-1的峰強高出很多，而且是尖銳的峰形，而1 361 cm_1的峰形為不明顯的肩峰，可見纖維二糖酶在pH 5．0時色氨酸為“埋藏式”，而在pH為2．0時是“暴露式”。另外在500～550 cm-1內(nèi)并沒有出現(xiàn)強的S—S伸縮振動譜帶，這可能說明纖維二糖酶并不含有二硫鍵。

3　結(jié)論

　　蛋白質(zhì)(酶)為由氨基酸連接成鏈的肽鍵組成，在肽鏈的不同部分之間，存在著靜電的相互作用。靜電吸引有助于維持蛋白質(zhì)的構(gòu)象，靜電排斥可以使蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致構(gòu)象松散或變化。從本實驗測定的拉曼光譜結(jié)果來看，纖維二糖酶在pH 5．0的溶液中，其結(jié)構(gòu)為口一螺旋和無規(guī)則卷曲；在pH 2．0時則主要為a一螺旋結(jié)構(gòu)，其主鏈構(gòu)象中的無規(guī)則卷曲發(fā)生較大變化，口一螺旋也受到一定影響。纖維二糖酶側(cè)鏈中的酪氨酸和色氨酸在pH5．0時均為“埋藏式”，而在pH 2．0時均為“暴露式”。此外，在500～550 cm_1并沒有出現(xiàn)強的S—S伸縮振動譜帶，這可能說明纖維二糖酶并不含有二硫鍵。結(jié)合在兩種pH情況下纖維二糖酶酶活的分析，表明pH變化對纖維二糖酶構(gòu)象的改變是造成酶活差異的主要原因，這對于進一步分析纖維二糖酶的活性中心與其構(gòu)象的關(guān)系具有重要的意義。