掃描電鏡制樣方法-臨界點(diǎn)干燥

一、原理

臨界點(diǎn)干燥法是利用臨界狀態(tài)下（介質(zhì)在某一特定壓強(qiáng)和溫度時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變成同時(shí)具有氣體和液體性質(zhì)）液體表面張力被消除的特性，使樣品中的液體氣化而最后完全干燥，是含水生物樣品干燥的一種方法。

當(dāng)液體處于臨界狀態(tài)時(shí)，消除了物相界面，表面張力等于零， 在此條件下使樣品干燥，能夠保此持樣品的結(jié)構(gòu)尤其是表面結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生變形，是掃描電鏡生物制樣的重要方法。

臨界狀態(tài)的條件：密閉容器中的液體加熱達(dá)到一定的溫度（臨界溫度）、臨界壓力。

臨界狀態(tài)的特性：氣、液密度相等，相界消失；液體變成氣體，液體的表面張力消失為零；無(wú)論施加多大的壓力，氣體不會(huì)變成液體。

二、CO2臨界點(diǎn)干燥法

臨界干燥液的選擇——置換液與中間液

置換液：在臨界點(diǎn)干燥器內(nèi)起臨界干燥作用的液體。如液體CO2。

中間液：用來(lái)置換脫水劑而后又被干燥劑所置換的液體。如丙酮、醋酸異戊酯。

水是極性分子，表面張力較大。對(duì)生物樣本進(jìn)行脫水處理時(shí)，水的臨界點(diǎn)（+374℃、22MPa）進(jìn)行操作很不方便且容易損壞樣本。而CO2的臨界點(diǎn)（+31℃、7.4MPa），易于達(dá)到和操作。然而CO2不易與水混合，通常采用丙酮/醋酸異戊酯作為中間介質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)：避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。操作較方便快捷。

三、制樣步驟

1.取材&固定：

1）用干凈、鋒利的刀、剪迅速切取組織，避免拉、鋸、壓等動(dòng)作。

2）盡快將組織放入4℃固定液（5%戊二醛，無(wú)細(xì)胞壁樣品2.5%即可），樣品如漂浮在固定液上，需脫氣處理（抽真空），使樣品完全浸沒(méi)于固定液內(nèi)。

3）樣品塊的長(zhǎng)寬高均不超過(guò)5mm。

4）固定液用0.1M的磷酸緩沖液（PH=7.2）配制，避免細(xì)胞萎縮或吸漲。

*緩沖液濃度及PH，可根據(jù)文獻(xiàn)自行調(diào)節(jié)。

注意事項(xiàng)：

1）固定時(shí)間4-12h（有細(xì)胞壁12h，無(wú)細(xì)胞壁6h）。

2）可在組織或器官上滴加固定液，半小時(shí)后取材，樣品浸泡在固定液中進(jìn)行樣品再進(jìn)行大小的修正。樣品越小越好。

3）樣品聚集時(shí)，可用移液槍吸打固定液重懸樣品，確保固定充分。

2.脫水

1）0.1M 磷酸緩沖液（PH=7.2）室溫沖洗浸泡3次，每次20min。

2）吸棄溶液，加入30％乙醇，4℃，20min。

3）吸棄溶液，加入50％乙醇，4℃，20min。

4）吸棄溶液，加入70％乙醇，4℃，20min。

5）吸棄溶液，加入80％乙醇，4℃，20min。

6）吸棄溶液，加入95％乙醇，4℃，20min。

7）吸棄溶液，加入100％乙醇，4℃，20min。

8）吸棄溶液，置換到100％丙酮（或醋酸異戊酯），4℃，2次，每次20min。

若中途需要暫停操作，請(qǐng)停留在第4）步，勿將組織放在高濃度酒精溶液過(guò)久。

注意事項(xiàng)：

1）盡量避免樣品貼壁或結(jié)團(tuán)，可輕彈管壁或滴管來(lái)回吸打固定液，打散樣品。2）注意易碎或非常小的樣品，更換液體時(shí)動(dòng)作要迅速，否則會(huì)在樣品表面產(chǎn)生空氣膜，影響脫水和干燥的效果。

3.干燥

樣品移至樣品室→用液體CO2置換磷酸丙酮/醋酸異戊酯 →CO2汽化→排氣→干燥完畢。