HPLC幾項關鍵性能技術指標的測試方法

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1、靈敏度的測試方法

HPLC的靈敏度可定義為：一、定量的物質(zhì)，通過HPLC的檢測器時，儀器所給出的信號大小就叫做該HPLC的靈敏度，有時也稱為響應值。對使用者來講，總是希望HPLC儀器有較高的靈敏度，因為靈敏度高，就意味著對等量的同一樣品進行檢測時，儀器有較大的輸出信號。但是，靈敏度的高低，并不能表示HPLC儀器的檢測能力。只有檢出限，才能表示儀器的最大檢測能力。

HPLC靈敏度的測試方法：主要根據(jù)信噪比的定義進行測試。一般取信號等于或大于噪聲2倍時的檢測量或濃度(信號強度)作為HPLC的信號大小。信號與噪聲二者相除即為儀器的信噪比(靈敏度，但是要求S/N≧2)。

2、檢測限測試方法

講HPLC的指標、給出HPLC的譜圖，應該實事求是的給出使用的靈敏度量程(一般使用最靈敏量程)，給出樣品濃度(一般是噪聲的3倍左右)，才能說明儀器的檢測限或靈敏度。

3、光學類檢測器噪聲的測試方法

HPLC的噪聲是一種與被測樣品無關的、隨機輸出的信號。國際上對噪聲的定義、測試方法各異。例如：美國材料協(xié)會制訂的測試標準(ASTM)，規(guī)定噪聲分為長噪聲、短噪聲、和超短噪聲三種。長噪聲是指每小時內(nèi)有6個至60個變化周期的噪聲，所以，測定時間至少應該測試一小時;短噪聲是指每小時內(nèi)有1個至10個變化周期的噪聲，所以，測定時間至少應該測試10分鐘至60分鐘內(nèi);超短噪聲是指每分鐘內(nèi)有10個以上的變化周期的噪聲，所以，測定時間應該大于1分鐘。

從使用者的角度看，噪聲又分為靜態(tài)噪聲和動態(tài)噪聲。其測試方法如下：

1)靜態(tài)噪聲測試：冷態(tài)開機(關機2小時后開機)，預熱30分鐘，連續(xù)測試1小時。在這1小時里，任取10分鐘(包含最差的峰-峰值)，在這10分鐘里取峰對峰值(P-T0-P)的最大值，就是儀器的噪聲。但是，10分鐘里的峰對峰(P-T0-P)值，不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值，即：“10分鐘里的峰對峰”值，不等于瞬時的峰-峰(P-P)值，測試數(shù)據(jù)前面應加“±”符號。

注意：開機30分鐘后，儀器調(diào)整到最靈敏度檔(如：對量程為0.005-3.0AUFS的儀器，取0.005AUFS，即縱坐標設置為0.005A);設置波長λ=250nm(有人設置500 nm，但最好測試250 nm);設置0 Abs(即時間掃描，吸光度從0點開始測試);光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不需選擇)。

在上述條件下，連續(xù)測試1小時(用儀器上的CRT指示輸出，或用數(shù)字電壓表監(jiān)測)。在1小時內(nèi)，任取10分鐘的峰對峰值(P-T0-P)，其最大者前面加“±”符號，即是儀器的噪聲。目前，國際上大多數(shù)科技工作者，基本上采用這種方法測試HPLC儀器的靜態(tài)噪聲。

有些科技工作者，認為在10分鐘的峰對峰值(P-T0-P)前如果要加“±”符號，就應對峰-峰值的絕對值先除“2”。這種做法是不妥的，會低估儀器的噪聲。因為噪聲是隨機的，可能是“+”值也可以是“-”值。

上述儀器條件的設置，在有些儀器上是不需要的，因為由于計算機的發(fā)展和普遍應用，很多儀器的坐標設置，完全由儀器的計算機自動設置。

2)動態(tài)噪聲測試：

作者在研發(fā)檢測器和使用HPLC時所采用的測試動態(tài)噪聲方法如下：連接恒流泵、液相色譜分離柱和檢測器。在恒流泵和檢測器中有移動相(流動相)流動。

具體操作方法如下：

冷態(tài)開機，預熱30分鐘，設恒流泵的流速1mL/min;檢測器設置：儀器調(diào)整到最靈敏度檔(如：0.005AUFS;即縱坐標設置為0.005AU);波長λ=250nm(有人設置500 nm，但最好測試250 nm)、0 Abs(即時間掃描，吸光度和時間都從0點開始測試)，光譜帶寬(SBW)=2nm(固定光譜帶寬的儀器不能選擇)，連續(xù)測試1小時，可以用儀器上的CRT指示噪聲在這1小時里，任取10分鐘(包含最差的峰-峰值)，在這10分鐘里取峰對峰值(P-T0-P)的最大值，就是儀器的噪聲。但是，10分鐘里的峰對峰(P-T0-P)值，不同于10分鐘里的任一地方的峰-峰(P-P)值，即：“10分鐘里的峰對峰”值，不等于瞬時的峰-峰(P-P)值。測試數(shù)據(jù)前面應加“±”符號。目前，國際上基本上采用這種方法測試HPLC儀器的動態(tài)噪聲。有時候，為了節(jié)省時間，也可以在漂移測試的基礎上檢測噪聲。但是開機時間就不是30分鐘，而是2小時。這樣所得測試數(shù)據(jù)稍小于開機30分鐘的數(shù)據(jù)(因此，給出數(shù)據(jù)時要說明方法)，數(shù)據(jù)處理方法仍如上所述。

3)目前國內(nèi)外的HPLC制造商，往往在儀器樣本上給出的都是檢測器的靜態(tài)噪聲，同時注明了儀器的狀態(tài)(檢測器空池)。這樣做，對于使用者了解整個儀器系統(tǒng)中的檢測器性能有利，也是可以的。但是不符合使用者的總體要求，因為使用者的總體要求是：整個HPLC系統(tǒng)(包括泵、柱、檢測器)處在使用狀態(tài)(動態(tài))的情況下，整機的噪聲有多大。所以，作者認為靜態(tài)噪聲可以給出，也可以不給出，但是動態(tài)噪聲必須給出。

注意：噪聲測試時，國際接軌的做法是在500nm。但是有些廠商卻給出700nm處測試的噪聲，這也是不對的。因為波長短，能量大;500nm處的能量比700nm處大，所以在700nm處測試的噪聲，數(shù)據(jù)會偏小，數(shù)據(jù)不真實。

4)中國的HPLC國家標準(2011版)和計量檢定規(guī)程JJG705-2002也規(guī)定了噪聲的測試方法，但是分別都還有一些值得推敲的問題，請大家自己參閱。

5)這里特別需要提出的是：目前有些國外HPLC生產(chǎn)廠商，為了吸引用戶，制造了一些違背儀器學理論的指標。例如：國外某廠商，在招標中給出HPLC的噪聲時，先采用計算機對噪聲進行平滑，并且采用最大量程測試，結(jié)果給出的HPLC噪聲非常小、譜圖基線非常平直、譜峰尖而陡直，給人的印象是世界一流的HPLC。其實不然，給出的數(shù)據(jù)和譜圖都是虛假的。如果用盲樣進行比對測試，因為他們的HPLC的噪聲大，信噪比差，靈敏度差，所以立即敗下陣來。

我國三聚氰胺國標的建立過程中的比對測試結(jié)果就是如此，專家們從三家公司(兩家外企,一家國產(chǎn)儀器公司(普析通用公司))的三種HPLC全方位比對測試的結(jié)果(標樣由國家標物中心提供)中，最后選用了國產(chǎn)北京普析通用的早期HPLC產(chǎn)品L6作為國家建標的儀器(L6是《原料乳三聚氰胺快速測定--液相色譜法》國家標準中采用的唯一國產(chǎn)儀器)，其根本原因是L6的比對測試數(shù)據(jù)準確可靠、噪聲小、S/N高、性價比高等等。

4、穩(wěn)定性(基線漂移和重復性)測試方法：

這里包括儀器的靜態(tài)基線漂移和動態(tài)基線漂移的測試方法：

一般來說，使用者不關心單個檢測器的靜態(tài)指標，所以，可以不專門測試檢測器的靜態(tài)基線漂移。但是，作者認為設計、制造者應該測試靜態(tài)基線漂移這個指標，測試方法與測試整機(系統(tǒng))的動態(tài)基線漂移完全相同。

動態(tài)基線漂移測試方法如下：冷態(tài)開機，預熱2小時，連續(xù)測試1小時。1小時內(nèi)的最大最小值之差就是動態(tài)漂移。(也有測試更長時間的，例如作者在FLD檢測器研發(fā)時，為了考察儀器的長時間漂移，連續(xù)測試48小時，儀器的漂移小于5mV)。

5、重復性及其測試方法：與漂移測試方法相同，對儀器進行多次測試(作者認為一般是5-7次)，其數(shù)據(jù)的符合程度就是重復性，一般用RSD表示。

6、量程范圍及其測試方法

1)定義

儀器能適用測量的范圍或儀器能滿足測量要求的范圍叫量程范圍。其表示方法為AUFS(Absorbance Unit Full Scale)或AU/FS(Absorbance Unit/Full Scale)。80年代以前，也有很多人用OD(光密度)這個概念表示Abs(Absorbance)，即用ODFS來表示UVD的量程，但是OD不符合光對物質(zhì)吸收的物理概念，不符合儀器學理論，所以，目前國際上已經(jīng)廢除“OD”概念，不能再使用“ODFS”了。

在實際的日常分析工作中，也有化學工作者用具體的化學物質(zhì)來描述HPLC的量程。但是不同物質(zhì)，由于摩爾吸光系數(shù)不同，表現(xiàn)出的靈敏度也不同，所以作者認為用具體的化學物質(zhì)來描述HPLC的量程不符合儀器學理論的要求。作者認為，給出AUFS最合適，其最大優(yōu)點是這種表示方法與樣品的性質(zhì)無關，便于比較同一類型檢測器的性能優(yōu)劣。但是這種表示方法對使用者來說不大直觀、不大方便。目前，國際上的HPLC儀器的量程范圍一般為：0.005-2.5AUFS(例如Waters的HPLC)。少數(shù)優(yōu)質(zhì)儀器的下限為0.001AUFS,但是有些儀器給出0.001-3.0AUFS的量程是有水分的，因為UVD的雜散光一般都比較大，而雜散光是光吸收類分析儀器主要分析誤差的來源，它主要限制被分析樣品濃度(吸光度)的上限。所以，HPLC的UVD給出0.001-3.0AUFS的量程一般是不準確的。

目前，國內(nèi)外很多HPLC儀器的UVD生產(chǎn)廠商不給儀器的量程，這是不妥的。因為，不給量程范圍就意味著不知道檢測器的靈敏度(下限)，不知道多少吸光度時儀器能達到滿度。當然，目前有很多HPLC儀器的UVD生產(chǎn)廠商，給出了儀器對某一物質(zhì)的最小檢測濃度或最小檢測量，這在某種程度上也可以反映儀器的靈敏度，并且對使用者來說，比較方便、比較直觀。但是，這種表示方法只是對某一物質(zhì)而言，特別是會帶來樣品處理產(chǎn)生的誤差、容易低估儀器噪聲的影響，因此，從儀器學理論的角度來看是不科學的。

2)量程范圍測試方法

目前，國際上對HPLC的UVD的量程范圍設計指標，一般在0.005-3.0AUFS內(nèi)。作者在研制HPLC的UVD檢測器時，用原上海大華儀表廠生產(chǎn)的XWT-204記錄儀的1V檔測試。當對數(shù)放大器的差分放大器的總輸出為1V時，記錄儀滿度(100格)。當儀器的有效光電信號從0.005-3.0V時，均可保證對數(shù)放大器的輸出為1V;此時，這個0.005-3.0V對應的吸光度為0.005-3.0Abs。要求從0.005-3.0Abs時，光度準確度都能保證在1%以內(nèi)(即1V±10mv)。如此測量3次并取均值，即是HPLC的量程范圍(0.005-3.AUFS)。

目前，國內(nèi)外許多制造商都用萘或者蒽來測試HPLC系統(tǒng)的靈敏度，這種做法也可以，但是從儀器學理論角度考量，作者認為不科學。因為：①、不能給出儀器的測量范圍，只能給出萘的最小檢測濃度;②、試樣的配制會帶來很多誤差;③、這種方法所作的測試，實際上是計算出來的靈敏度，而不是測試出來的真正的靈敏度，不能反應儀器真正的靈敏度。如果實際測試，肯定比計算的數(shù)據(jù)大很多。④、不與國際接軌，不便比較不同儀器的性能。雖說近幾年國內(nèi)外采用此方法的科技工作者比過去多，但是不能掩蓋方法的局限性。所以，最好的方法還是給出儀器的測量范圍。

還有人用靜態(tài)噪聲的2倍或3倍來計算最小檢測濃度，這樣計算出來的結(jié)果，同樣是不真實的。因為從儀器學理論角度來看，一般在正常情況下，最小檢測濃度是在系統(tǒng)處在動態(tài)的情況下測試的，所以計算最小檢測濃度就必須用動態(tài)噪聲，而不能用靜態(tài)噪聲。

還有人測試HPLC的最小檢測濃度時，采用一些計算公式(如：Cmin=2NC/H×20，式中：Cmin 為最小檢測濃度，N為儀器的噪聲;C為濃度，H為峰高)，計算時不考慮移動相的流速，這是不妥的。不考慮移動相的流速或計算公式中去掉移動相的流速，就意味著是靜態(tài)的最小檢測濃度，而使用者需要的是系統(tǒng)的動態(tài)最小檢測濃度。所以作者認為這種計算方法很不合理，對使用者來講是沒有意義的，這種計算方法不可采用。