圓二色譜儀-圓二色光譜儀

一.簡介

圓二色光譜(簡稱：CD)是應(yīng)用最為廣泛的測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法，是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單、較準(zhǔn)確的方法。它可以在溶液狀態(tài)下測定，較接近其生理狀態(tài)。而且測定方法快速簡便，對構(gòu)象變化靈敏，所以它是目前研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要手段之一，并已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中。

鑠思百檢測可提供圓二色光譜檢測服務(wù)。

用于推斷非對稱分子的構(gòu)型和構(gòu)象的一種旋光光譜。光學(xué)活性物質(zhì)對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圓二色性。如果以不同波長的平面偏振光的波長λ為橫坐標(biāo)，以吸收系數(shù)之差Δε=εL-εR為縱坐標(biāo)作圖，得到的圖譜即是圓二色光譜，簡稱CD。如果某手性化合物在紫外可見區(qū)域有吸收，就可以得到具有特征的圓二色光譜。由于εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，摩爾橢圓度[θ]與Δε的關(guān)系為：[θ]=3300Δε。圓二色譜也可以摩爾橢圓度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖。由于△ε有正值和負(fù)值之分，所以圓二色譜也有呈峰的正性圓二色譜和呈谷的負(fù)性圓二色譜。在紫外可見光區(qū)域測定圓二色譜與旋光譜，其目的是推斷有機化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。

二．原理

光是橫電磁波，是一種在各個方向上振動的射線。其電場矢量E 與磁場矢量H 相互垂直，且與光波傳播方向垂直。由于產(chǎn)生感光作用的主要是電場矢量，一般就將電場矢量作為光波的振動矢量。光波電場矢量與傳播方向所組成的平面稱為光波的振動面。若此振動面不隨時間變化，這束光就稱為平面偏振光，其振動面即稱為偏振面。平面偏振光可分解為振幅、頻率相同，旋轉(zhuǎn)方向相反的兩圓偏振光。其中電矢量以順時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右旋圓偏振光，其中以逆時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為左旋圓偏振光。兩束振幅、頻率相同，旋轉(zhuǎn)方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光。如果兩束偏振光的振幅(強度) 不相同,則合成的將是一束橢圓偏振光。　

光學(xué)活性物質(zhì)對左、右旋圓偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值ΔA ( Al - Ad) 稱為該物質(zhì)的圓二色性(circular dichroism ,簡寫作CD) 。圓二色性的存在使通過該物質(zhì)傳播的平面偏振光變?yōu)闄E圓偏振光,且只在發(fā)生吸收的波長處才能觀察到。所形成的橢圓的橢圓率θ為:θ= tg- 1 短軸/長軸

根據(jù)Lambert-Beer 定律可證明橢圓率近似地為：θ= 0. 576 lc (εl - εd) = 0. 576 lcΔε 公式中l(wèi) 為介質(zhì)厚度, c 為光活性物質(zhì)的濃度,εl 及εd分別為物質(zhì)對左旋及右旋圓偏振光的吸收系數(shù)。測量不同波長下的θ(或Δε) 值與波長λ之間的關(guān)系曲線,即圓二色光譜曲線。在此光譜曲線中,如果所測定的物質(zhì)沒有特征吸收,則其Δε值很小,即得不到特征的圓二色光譜。當(dāng)εl >εd 時,得到的是一個正的圓二色光譜曲線,即被測物質(zhì)為右旋,如果εl <εd ,則得到一個負(fù)的圓二色光譜曲線,即被測物質(zhì)為左旋?！?/p>

根據(jù)圓二色光譜法的原理和測試要求設(shè)計制成的儀器稱為圓二色光譜儀。目前圓二色光譜法及其儀器已廣泛應(yīng)用于有機化學(xué)、生物化學(xué)、配位化學(xué)和藥物化學(xué)等領(lǐng)域,成為研究有機化合物的立體構(gòu)型的一個重要方法。

三．樣品要求

1、樣品必須保持一定的純度不含光吸收的雜質(zhì)，溶劑必須在測定波長沒有吸收干擾;樣品能完全溶解在溶劑中, 形成均一透明的溶液。

2、氮氣流量的控制

3、緩沖液、溶劑要求與池子選擇：緩沖液和溶劑在配制溶液前要做單獨的檢查，看是否在測定波長范圍內(nèi)有吸收干擾， 看是否形成沉淀和膠狀；在蛋白質(zhì)測量中，經(jīng)常選擇透明性極好的磷酸鹽作為緩沖體系。

4、樣品濃度與池子選擇

樣品不同，測定的圓二色光譜范圍不同，對池子大小(光徑)的選擇和濃度的要求也不一樣。蛋白質(zhì)CD光譜測量一般在相對較稀的溶液中進行。

四．譜帶寬度

1、選為1 nm。對于高分辨率測量，要用較窄的狹縫寬度，此時光電倍增管的電壓較高，譜的信噪比差。雖然對于正常測量最佳譜帶寬度是1~2 nm，但是在下列情況下要犧牲分辨率而需要較寬的狹縫寬度。當(dāng)樣品的吸光度很高但CD信號很弱時，一方面要盡量保證測定CD峰所需要的足夠濃度，另一方面要設(shè)置較寬的狹縫。不過此時要特別小心，因為樣品在吸光度過高(A>2)的情況下可能存在熒光或雜散光引起的某些假象。另外，在固體CD光譜測試時也需要較大的狹縫寬度(一般要求 > 2 nm)。

2、橢圓率和摩爾橢圓率都依賴于測量條件。因此，溫度、波長和樣品濃度總是應(yīng)該特別注明的。

3、當(dāng)用壓片法或石蠟油研磨法進行固體粉末樣品測試時，要盡可能地研磨獲得細(xì)小均勻的樣品顆粒。采用石蠟油糊方法時，必須注意某些憎水有機化合物可能溶于石蠟油中，這時所得CD光譜在某種意義上應(yīng)視為溶液CD光譜。采用壓片法測試固體CD時，在保證手性樣品的定性濃度達到CD光譜儀檢測要求的同時，片越薄越透明越好(但切忌破損)。在某些情況下，壓片法不適用于手性抗衡陰離子存在下的固體誘導(dǎo)CD光譜的測定。

五．各品牌圓二色譜儀參數(shù)對比

目前圓二色光譜儀的主流產(chǎn)品包括：法國Bio-Logic MOS-500，美國Olis DSM-17，日本Jasco J-1500，英國Chirascan qCD