圓二色譜原理和樣品要求

一.圓二色譜簡介

圓二色光譜（簡稱CD）是測定蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)最廣泛的方法，是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的快速、簡單、準(zhǔn)確的方法。它可以在溶液狀態(tài)下測量，更接近其生理狀態(tài)。而且測量方法快速簡單，對構(gòu)象變化敏感，是研究蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)的主要手段之一，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象研究中。

用于推斷不對稱分子的構(gòu)型和構(gòu)象的旋轉(zhuǎn)光譜。光學(xué)活性物質(zhì)對構(gòu)成平面偏振光的左右偏振光的吸收系數(shù)(ε)是不平等的，εL≠εR，也就是說，它具有圓二色性。不同波長的平面偏振光的波長λ作為橫坐標(biāo)，以吸收系數(shù)之差為基礎(chǔ)Δε=εL-εR為縱坐標(biāo)繪圖，得到的圖譜為圓二色光譜，簡稱CD。如果一種手性化合物被紫外線可見區(qū)域吸收，則可以獲得具有特征的圓二色光譜。因?yàn)棣臠≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，摩爾橢圓度[θ]與Δε的關(guān)系為：[θ]=3300Δε。圓二色譜也可以以摩爾橢圓度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)。因?yàn)??！鳓庞姓岛拓?fù)值，所以圓二色譜也有峰值正性圓二色譜和谷物負(fù)性圓二色譜。在紫外可見光區(qū)域測量圓二色譜和旋轉(zhuǎn)光譜的目的是推斷有機(jī)物的結(jié)構(gòu)和圖像。

二．圓二色譜原理

光是橫向電磁波，是一種在各個(gè)方向振動的射線。其電場矢量E與磁場矢量H相互垂直，并與光波傳播方向垂直。由于電場矢量通常產(chǎn)生感光效果，因此電場矢量通常被視為光波的振動矢量。光波電場矢量與傳播方向組成的平面稱為光波振動面。如果振動面不隨時(shí)間變化，則稱為平面偏振光，其振動面稱為偏振面。平面偏振光可分解為振幅和頻率相同、旋轉(zhuǎn)方向相反的兩個(gè)圓偏振光。其中，電矢量順時(shí)針旋轉(zhuǎn)稱為右旋圓偏振光，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)稱為左旋圓偏振光。兩束振幅和頻率相同、旋轉(zhuǎn)方向相反的偏振光也可以產(chǎn)生一束平面偏振光。如果兩束偏振光的振幅（強(qiáng)度）不同，則合成一束橢圓偏振光。

光學(xué)活性物質(zhì)對左右旋圓偏振光的吸收率不同，光吸收的差異ΔA(Al-Ad)這種物質(zhì)叫圓二色性(circulardichroism,簡寫CD)。圓二色的出現(xiàn)使通過物質(zhì)傳播的平面偏振光變成橢圓偏振光，只能在吸收的波長處觀察到。橢圓的橢圓率θ為:θ=tg-1短軸/長軸

根據(jù)Lambert-beer定律，可以證實(shí)橢圓率相似：θ=0.576lc(εl-εd)=0.576lcΔε在公式中，L是介質(zhì)薄厚，C是光活性成分的濃度，εl及εd是物質(zhì)對左旋和右旋偏振光的吸收系數(shù)。測量不同波長下的波長。θ(或Δε)值與波長λ兩者之間的關(guān)系曲線，即圓二色光譜曲線。在這種光譜曲線中，如果測定的物質(zhì)沒有被特征吸收，它們就會被特征吸收。Δε值很小，即得不到圓二色光譜的特點(diǎn)。當(dāng)它被用作時(shí)。εl>εd時(shí)，得到的是一個(gè)正的圓二色光譜曲線，即被測物質(zhì)為右旋，如果被測物質(zhì)為右旋，εl<εd,得到一個(gè)負(fù)圓二色光譜曲線，即被測物質(zhì)為左旋。

根據(jù)圓二色光譜法的原理和測試要求設(shè)計(jì)的儀器稱為圓二色光譜儀。目前，圓二色光譜法及其儀器已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、配位化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域，已成為研究有機(jī)物三維結(jié)構(gòu)的重要方法。

三．圓二色譜樣品要求

1、樣品必須保持一定的純度，不含光吸收雜質(zhì)，測定波長時(shí)溶劑必須無吸收作用；樣品可完全溶解在溶劑中，產(chǎn)生均勻透明的溶液。

2、控制氮?dú)饬髁?/span>

3、緩沖液、溶劑要求和池選擇：緩沖液和溶劑在制備溶液前應(yīng)獨(dú)立檢查，檢查波長范圍內(nèi)是否有吸收影響，是否產(chǎn)生沉淀和膠水；在蛋白質(zhì)測量中，通常選擇透明磷酸鹽作為緩沖系統(tǒng)。

4、樣品濃度和水池選擇

樣品不同，圓二色光譜范圍不同，對池尺寸（光徑）選擇濃度的要求也不同。蛋白質(zhì)CD光譜測量通常在相對較薄的溶液中進(jìn)行。

四．圓二色譜譜帶總寬

1、選擇1nm。對于高分辨率測量，應(yīng)使用較窄的狹縫總寬度。此時(shí)，光電倍增管的電壓較高，光譜的信噪比較差。雖然正常測量的最佳光譜帶總寬度為1~2nm，但在以下前提下，為了犧牲分辨率，需要較寬的狹縫總寬度。當(dāng)樣品吸光率高但CD信號弱時(shí)，一方面要盡量保證測量CD峰所需的充足濃度，另一方面要設(shè)置較寬的狹縫。但此時(shí)要特別小心，因?yàn)闃悠返奈饴侍?A>2）在這種情況下，可能會出現(xiàn)一些由閃光或雜散光引起的錯(cuò)覺。此外，在固態(tài)CD光譜檢測中，還需要較大的狹縫總寬度（一般要求>2nm）。

2、橢圓率和摩爾橢圓率都取決于測量條件。因此，應(yīng)特別注明溫度、波長和樣品濃度。

3、當(dāng)用壓片法或石蠟油研磨法進(jìn)行固體粉末樣品測試時(shí)，要盡可能地研磨獲得細(xì)小均勻的樣品顆粒。采用石蠟油糊方法時(shí)，必須注意某些憎水有機(jī)化合物可能溶于石蠟油中，這時(shí)所得CD光譜在某種意義上應(yīng)視為溶液CD光譜。采用壓片法測試固體CD時(shí)，在保證手性樣品的定性濃度達(dá)到CD光譜儀檢測要求的同時(shí)，片越薄越透明越好(但切忌破損)。在某些情況下，壓片法不適用于手性抗衡陰離子存在下的固體誘導(dǎo)CD光譜的測定。