鑠思百檢測(cè)DETECTION
OF TECHNICAL SOUSEPAD
DETECTION OF TECHNICAL SOUSEPAD
聚焦離子束掃描電子顯微鏡（FIB-SEM） 二維碼
發(fā)表時(shí)間：2020-10-13 10:06作者：鑠思百檢測(cè)來(lái)源：鑠思百檢測(cè) 鑠思百檢測(cè)可提供FIB制樣服務(wù)，具體聯(lián)系客服。 這里用到了兩項(xiàng)技術(shù)FIB-SEM和3D-SR，原理上分開(kāi)理解一下。FIB-SEM的全稱(chēng)叫Cyro-Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy，我們知道SEM是利用聚焦電子束掃描樣品的表面來(lái)產(chǎn)生樣品表面的圖像，不同的是，這里在電子束的基礎(chǔ)上添加了一個(gè)聚焦離子束，它的作用是對(duì)樣品進(jìn)行表面刻蝕，每次刻蝕完SEM就立馬對(duì)新的表面進(jìn)行掃描成像，這樣無(wú)縫的銜接就實(shí)現(xiàn)了一個(gè)三維的SEM成像效果 (裝置如圖)。
FIB-SEM原理 圖片來(lái)源于Briggman and Bock, Curr. Op. in Neurobiol. 2012 與它類(lèi)似的另外一項(xiàng)技術(shù)叫3D EM by diamond knife serial array，目的是類(lèi)似的，都想通過(guò)這種切片的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)3D的掃描成像，不同之處在于后者不用離子束而是用刀，可以看這張圖，這樣一層一層削沒(méi)辦法做到離子束刻蝕那樣可控，效果上自然會(huì)差一些。
3D EM by diamond knife serial array 我猜有人會(huì)說(shuō)，為什么不用冷凍電鏡呢？作者這里也提到了，冷凍電鏡雖然可以提供亞納米級(jí)得三維分辨率，但一般來(lái)說(shuō)只能拿它來(lái)分析一些亞微米厚度的細(xì)胞切片或者提取出來(lái)的一些生物大分子。所以想對(duì)整個(gè)細(xì)胞成像，冷凍電鏡并不是最佳選擇。 那么問(wèn)題來(lái)了，EM分辨率上自然好過(guò)LM，但是大家都看過(guò)SEM效果，一般來(lái)說(shuō)就是一張灰度圖，雖然后續(xù)可以添上偽彩之類(lèi)的。所以缺點(diǎn)是特異性比較差，沒(méi)辦法識(shí)別到準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)或者蛋白的分布。因此為了實(shí)現(xiàn)特異性的結(jié)構(gòu)可視化，且要具備較高的分辨率，作者這里選擇與超分辨成像技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用。之前的研究中，在涉及到光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡聯(lián)用，特別是需要化學(xué)固定時(shí)，一般會(huì)在LM熒光保留度，EM染色致密度以及結(jié)構(gòu)完整性之間進(jìn)行權(quán)衡。所以這里作者也是花了心思，希望能避免這種妥協(xié)。 驚喜的是，他們發(fā)現(xiàn)如果不采用化學(xué)固定（例如常用的4%的多聚甲醛），而通過(guò)高壓冷凍固定的方法，可以得到更好的亞結(jié)構(gòu)保存度，而且在進(jìn)行熒光超分辨成像時(shí)可以提供更佳的成像對(duì)比度（低溫下噪聲被很好地抑制了）。同時(shí)也能避免化學(xué)固定對(duì)后續(xù)電鏡成像的影響，同時(shí)因?yàn)檫@套系統(tǒng)中電鏡和光學(xué)成像是分開(kāi)采集的，樣品也無(wú)需同時(shí)進(jìn)行熒光和EM染色，protocol也是完全獨(dú)立的。 這是整個(gè)系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)流程以及原理圖。 系統(tǒng)原理圖 細(xì)胞通過(guò)正常方法培養(yǎng)在蓋玻片上，通過(guò)高壓冷凍固定并轉(zhuǎn)移至低溫?zé)晒怙@微鏡進(jìn)行超分辨熒光成像。這里采用了兩種超分辨成像技術(shù)，SIM和SMLM（原理這里略過(guò)了，網(wǎng)上應(yīng)該很容易搜到），SIM的優(yōu)點(diǎn)是成像速度快，但是分辨率不及SMLM。光學(xué)成像完成后，需要對(duì)樣品EM染色，并將其嵌入到樹(shù)脂中用來(lái)實(shí)現(xiàn)后續(xù)的FIB-SEM成像。最后一步是需要將LM和EM的成像結(jié)果align到一起，實(shí)現(xiàn)一張全細(xì)胞的多模式成像。給大家看一下大概的成像效果，左邊是FIB-SEM成像，右邊是冷凍SMLM，分別標(biāo)記的是COS-7細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（綠色）和線(xiàn)粒體（品紅色）。 FIB-SEM與Cryo-SMLM聯(lián)用 原理差不多是這樣，接下來(lái)就具體介紹了這項(xiàng)技術(shù)在觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。例如用FIB-SEM可以看到各種形貌和尺寸的囊泡分散在細(xì)胞各處，但是他們有可能是過(guò)氧化物酶體、溶酶體、核內(nèi)體等各種形式的囊泡，這時(shí)候借助于熒光標(biāo)記，就可以區(qū)分出具體某一種囊泡。他們還發(fā)現(xiàn)尺寸小于0.01立方米的過(guò)氧化物酶體通常呈近球形，這可能是表面張力會(huì)驅(qū)使其呈現(xiàn)出更小的表面積。但隨著體積增大，它們會(huì)更傾向于呈現(xiàn)出片狀，碗狀或者中空結(jié)構(gòu)。作者猜測(cè)這也可能是為了調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體內(nèi)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)速率。當(dāng)然還有一些不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過(guò)氧化氫酶體，它們一般會(huì)跟跟其他細(xì)胞器靠得很近，這些組裝可能可以促進(jìn)不同的細(xì)胞器之間的貨物轉(zhuǎn)移，如過(guò)氧化物酶體和線(xiàn)粒體之間脂肪酸的連續(xù)分解。 不同尺寸過(guò)氧化物酶體呈現(xiàn)出不一樣的形貌 除此之外，這套系統(tǒng)還可以用來(lái)觀察染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域及其在神經(jīng)元分化過(guò)程中的重組，這部分感興趣的大家可以看下文章。 總結(jié)部分，作者對(duì)這套系統(tǒng)提出了改進(jìn)設(shè)想，希望能在冷凍之前進(jìn)行活細(xì)胞成像，這樣可以觀察到更多的動(dòng)態(tài)細(xì)節(jié)，同時(shí)可以促進(jìn)其在藥理學(xué)、光遺傳學(xué)等方面的應(yīng)用。但目前還沒(méi)辦法做到實(shí)時(shí)成像到快速冷凍之間的完美過(guò)渡。即使是這樣，目前這套設(shè)備已經(jīng)足夠用于解決多種生物學(xué)問(wèn)題。 |
