HPLC高效液相色譜儀原理

HPLC高效液相色譜儀原理

高效液相色譜儀的原理是什么？今天鑠思百檢測小編帶大家詳細(xì)了解一下！

一、HPLC高效液相色譜儀的原理

高效液相色譜儀也叫高壓液相色譜、高速液相色譜、高分離度液相色譜等，它是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

色譜法的分離原理是:溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

高效液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛，對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點(diǎn)、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。

由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點(diǎn)限制，因此具有更廣闊的應(yīng)用潛力。經(jīng)過30多年的迅速發(fā)展，高效液相色譜法在基礎(chǔ)理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟，現(xiàn)已成為化學(xué)化工、環(huán)境、藥學(xué)、食品等多個(gè)領(lǐng)域中最具優(yōu)勢的分離分析方法之一。

液相色譜根據(jù)分離機(jī)理的不同可分為:

• 液固吸附色譜

• 液液分配色譜

• 離子交換色譜

• 離子對(duì)色譜法

• 分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)

二、HPLC高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)組成

三、高效液相色譜儀常見問題

1. HPLC如何定量？

答∶HPLC定量時(shí)，最常使用外標(biāo)法（定量原理：峰面積或者峰高隨濃度的變化而相應(yīng)變化）。若使用其他定量方式，請(qǐng)?zhí)崆皽贤?。若使用外?biāo)法，除填寫對(duì)接單外，您需要在對(duì)接單中額外補(bǔ)充：

A、目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)品-做外標(biāo)；

B、目標(biāo)物質(zhì)的濃度范圍-決定外標(biāo)定量范圍。

2. HPLC如何定性？

答∶HPLC定性時(shí)，是以保留時(shí)間定性。此步驟也需要您提供標(biāo)準(zhǔn)品，通過比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品與待測物質(zhì)的保留時(shí)間來定性。如果您樣品成分復(fù)雜，存在待測物質(zhì)的出峰情況受樣品中其他物質(zhì)的干擾的可能性，就算保留時(shí)間能與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)上，但不能確認(rèn)樣品中含有該標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)。所以HPLC用于定性時(shí)目標(biāo)物質(zhì)純度應(yīng)該較高。

3. 目標(biāo)物質(zhì)含量較低，可能測不出怎么辦？

可以進(jìn)行濃縮的預(yù)處理，因?yàn)橐话闾烊粯油枯^低，低于檢出限，但是富集之后可以在檢出限內(nèi)進(jìn)行定量）。缺點(diǎn)是需要確認(rèn)合適的預(yù)處理步驟。

具體的濃縮的預(yù)處理過程務(wù)必由客戶提供，因?yàn)椴煌繕?biāo)物質(zhì)濃縮步驟往往有所區(qū)別，根據(jù)目標(biāo)物選擇合適的濃縮步驟，對(duì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有著至關(guān)重要的作用。

4. 儀器的檢出限是多少？

答∶正如毒理學(xué)中“拋開劑量談毒性”的含義，HPLC檢出限也并不是一個(gè)準(zhǔn)確值。

檢出限的定義為：某特定分析方法在給定的置信度內(nèi)可從樣品中檢出待測物質(zhì)的最小濃度或最小量。即，拋去其他細(xì)節(jié)因素，主要影響HPLC檢出限的是測試方法以及對(duì)應(yīng)測試物質(zhì)。

舉例：假如客戶A的樣品是液體樣，需要檢測其中四環(huán)素的含量。那么我們需要先按照測試方法設(shè)置好儀器，然后進(jìn)標(biāo)樣，直到可以判定標(biāo)品中存有濃度明顯高于空白（大多是3倍噪聲）的四環(huán)素出峰，這一標(biāo)樣濃度可以稱為檢出限。

如果在自身樣品各種信息都沒有提供的前提下，直接問儀器檢出限是多少？就說明欠缺對(duì)檢出限定義、HPLC基礎(chǔ)原理的理解。

5. HPLC和LCMS最顯著的區(qū)別？

答∶液相色譜可以后搭多種檢測器，如紫外檢測器，熒光檢測器、蒸發(fā)光檢測器、質(zhì)譜檢測器等。搭配質(zhì)譜檢測器的這類成為LCMS。兩者本身的重點(diǎn)就有所偏重。前面幾種檢測器，在判定物質(zhì)時(shí)，更依賴于標(biāo)品定性，一般是默認(rèn)一個(gè)峰為一個(gè)物質(zhì)，因此對(duì)分峰要求較為嚴(yán)格；而LCMS由于其質(zhì)譜檢測器的靈敏性，重點(diǎn)在于碎片的區(qū)分。即使LCMS上顯示是一個(gè)峰，也可以根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)判定前半個(gè)峰、后半個(gè)峰、甚至峰頂是否是同一個(gè)物質(zhì)。所以屬于兩種檢測手段，兩者數(shù)據(jù)不具有對(duì)比性。

溫馨提示

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