液相色譜中“體積”是什么意思？

大家在閱讀液相色譜的文章的時(shí)候，經(jīng)常能夠看到各種名字的“體積”，比如死體積、駐留體積、延遲體積、孔隙體積等等，這些“體積”到底都是些什么東西？它們對(duì)我的液相分析到底意味著什么呢？今天我們就看一看經(jīng)常用到的這三個(gè)體積。

死體積定義

指的是有效進(jìn)樣點(diǎn)到有效檢測(cè)點(diǎn)之間排除色譜柱中包含固定相部分的體積。包括 4 部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)， Vm ）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有 Vm 參與色譜平衡過程，其他3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。

系統(tǒng)死體積一般通過進(jìn)樣基本不保留的小分子來測(cè)定。尿嘧啶、丙酮和硫脲是反相色譜中最常用的測(cè)試物質(zhì)；死時(shí)間與死體積相關(guān)；可以用死體積除以流速測(cè)定。

死體積計(jì)算

對(duì)于HPLC來說，該如何計(jì)算死體積呢。

死體積(dead volume,V0)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。

死時(shí)間(dead time,t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過色譜柱的時(shí)間。

測(cè)量系統(tǒng)死體積通常需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量，常用方法是通過進(jìn)一針和色譜柱固定相沒有任何作用的特殊溶液時(shí)，就會(huì)得到一個(gè)色譜峰，由此峰可以測(cè)得死時(shí)間（t0），這就是t0的實(shí)測(cè)結(jié)果。

然后通過計(jì)算得到系統(tǒng)死體積:

死體積（V0) = 死時(shí)間t0×流動(dòng)相的流速F。

減少死體積

在我們使用或維護(hù)的過程中，如果涉及管路等配件的更換，應(yīng)該選擇與原規(guī)格一致的配件，以確保死體積與原來一致，避免死體積的增加而帶來峰形的展寬。

接裝色譜柱時(shí)，需確保管線接頭匹配完好（特別注意peek管接頭的使用，以及管線與色譜柱的連接處）避免形成接頭空腔（如下圖）。

駐留體積的定義

相同色譜柱，不同儀器

若想在不同儀器上使用相同尺寸的色譜柱，往往需要考慮駐留體積這個(gè)問題，因?yàn)椴煌v留體積的儀器使用同一方法也可能影響分析結(jié)果。在柱頭開始梯度洗脫時(shí)，需要確保通過色譜柱的流動(dòng)相體積相同。如果流動(dòng)相的體積不相同，結(jié)果也將不同。

若在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)不同駐留體積的 HPLC 儀器使用相同的方法，運(yùn)行結(jié)果很可能不完全相同，因?yàn)閮煞N（或多種）流動(dòng)相混合形成梯度后，將在各個(gè)儀器的流路內(nèi)經(jīng)過一段不同的時(shí)間后方能到達(dá)柱頭。因此，進(jìn)樣后受時(shí)間影響，分析物將通過不同的流動(dòng)相組分，其保留時(shí)間和分離度也會(huì)受到影響。如果將梯度方法從一臺(tái)儀器轉(zhuǎn)移到另一臺(tái)儀器，保留時(shí)間會(huì)根據(jù)兩個(gè)系統(tǒng)的駐留體積發(fā)生變化。流路體積越接近，結(jié)果的一致性越高。

延遲體積

延遲體積指的是溶劑混合點(diǎn)（通常在液相色譜儀的混合腔內(nèi)或比例閥中）與 LC 柱頭之間的體積。

在梯度洗脫或等度洗脫的溶劑組成改變時(shí)，延遲體積對(duì)于使色譜柱在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成流動(dòng)相組成的變化非常重要。低壓混合物系統(tǒng)的駐留體積一般比高壓混合系統(tǒng)大。

• 第一（最好的），某些系統(tǒng)控制器可以在梯度開始后的精確時(shí)間進(jìn)樣。如延遲進(jìn)樣時(shí)間tD，梯度和樣品可同時(shí)到達(dá)柱進(jìn)口。
• 第二，如梯度過程開始可插入一段等度過程，用VD值較大的系統(tǒng)時(shí)則可以縮短這一過程；而用VD值較小的系統(tǒng)時(shí)則可延長(zhǎng)這一過程。以此方式，樣品和梯度則會(huì)同時(shí)達(dá)到柱進(jìn)口。
• 第三，以一較陡梯度從5%B至初始%B開始。

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