NMR的原理與分析

NMR的基本原理

核磁共振（NMR）是指自旋量子數(shù)不為零的原子核（比如¹H、¹³C、²⁷Al、²⁹Si等）在靜磁場（B₀）作用下，核自旋能級(jí)發(fā)生塞曼（Zeeman）能級(jí)裂分，其能級(jí)差為：ΔE = ?ω₀，若對(duì)該體系施加一個(gè)垂直于靜磁場方向且能量等于相鄰能級(jí)間能量差的射頻場（B₁）時(shí)，核自旋能級(jí)間產(chǎn)生共振躍遷的過程。自旋核在射頻場作用下會(huì)繞靜磁場B₀旋轉(zhuǎn)，稱為拉莫爾（Larmor）進(jìn)動(dòng)。Larmor頻率ω的大小取決于原子核的種類和外磁場的大?。?em>ω = γB₀。

NMR實(shí)驗(yàn)常用測量參數(shù)

（1）化學(xué)位移和J偶合

化學(xué)位移作用，也稱屏蔽作用，是指在磁場中，由于原子核外電子的運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生一個(gè)小的磁場B_e（local field），此小磁場與外加磁場B₀方向相反，從而使原子核感受到一個(gè)比外加磁場小的磁場的現(xiàn)象。一方面，分子中不同原子核周圍電子屏蔽效應(yīng)不同導(dǎo)致不同原子核感受到的外磁場強(qiáng)度不同；另外，由于鄰近核自旋的影響，在不同化學(xué)環(huán)境中相同自旋核的拉莫爾頻率也會(huì)出現(xiàn)偏差。因此化學(xué)位移能夠反映原子核在分子中的化學(xué)環(huán)境或原子核附近的電子云密度分布，可作為鑒別或測定化合物結(jié)構(gòu)的重要依據(jù)?；瘜W(xué)位移（δ）是相對(duì)值，一般情況下會(huì)選擇一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比如四甲基硅烷（TMS）的質(zhì)子化學(xué)位移作為標(biāo)準(zhǔn)。

J耦合，即自旋-自旋耦合作用，指相鄰原子核通過化學(xué)鍵（電子云）發(fā)生的作用。兩個(gè)自旋核之間的耦合作用大小稱為J耦合常數(shù)。J耦合會(huì)引起共振峰的分裂而形成多重峰；多重峰包含了相互作用的原子核彼此間的空間結(jié)構(gòu)信息。

化學(xué)位移和J耦合常數(shù)是NMR中很重要的兩個(gè)參數(shù)。不同化學(xué)基團(tuán)上的¹H或者¹³C的化學(xué)位移不同，不同分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)中J耦合裂分方式也不同，這些差異為NMR應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)解析奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

（2）弛豫時(shí)間

當(dāng)磁化矢量在某一時(shí)間受到外界擾動(dòng)時(shí)，其磁化矢量即處于非平衡狀態(tài)，當(dāng)擾動(dòng)去除后，磁化矢量就要向著平衡方向移動(dòng)，這一過程稱為弛豫過程。弛豫時(shí)間分別為縱向弛豫時(shí)間（T₁）和橫向弛豫時(shí)間（T₂），也分別稱為自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫時(shí)間。其中，T₁是縱向磁化強(qiáng)度向平衡狀態(tài)恢復(fù)的時(shí)間，T₂是橫向磁化強(qiáng)度向平衡狀態(tài)恢復(fù)的時(shí)間。弛豫時(shí)間與核之間的化學(xué)位移各向異性、偶極-偶極相互作用、四極相互作用等方面有關(guān)。通過測量弛豫時(shí)間，不僅可以獲得分子運(yùn)動(dòng)性的相關(guān)信息，還可以獲得常規(guī)液體譜圖上無法獲得信息，例如各向同性液體樣品中的偶極-偶極耦合信息。弛豫時(shí)間的測定是許多NMR實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

（3）自擴(kuò)散系數(shù)

自擴(kuò)散，是一種無規(guī)則的運(yùn)動(dòng)，類似于布朗運(yùn)動(dòng)，是指均勻分布相同粒子下的單個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)，其周圍的粒子都是隨機(jī)的，即在不存在化學(xué)勢梯度時(shí)的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。自擴(kuò)散系數(shù)是用來衡量分子運(yùn)動(dòng)快慢的重要參數(shù)。假設(shè)分子為球形，其處于粘度為?的連續(xù)介質(zhì)中的擴(kuò)散系數(shù)可以用Stokes-Einstein方程描述：

其中，D為自擴(kuò)散系數(shù)，k為Boltzman常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，R_H為球形分子的水合動(dòng)力學(xué)半徑。從公式中可看出，自擴(kuò)散系數(shù)大小與分子形狀尺寸、體系溫度、溶液粘度及分子間相互作用等密切相關(guān)，也就是說，任何能夠改變分子整體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的物理或化學(xué)變化都可在自擴(kuò)散系數(shù)上表現(xiàn)出來。因此，可通過測量自擴(kuò)散系數(shù)來研究各種體系中分子的聚集狀態(tài)及分子間相互作用等。

隨著脈沖梯度場技術(shù)的發(fā)展，用NMR測定分子自擴(kuò)散系數(shù)已經(jīng)成為NMR動(dòng)為學(xué)中的重要組成部分。

（4）二維同核NMR實(shí)驗(yàn)

COSY譜（Correlation Spectroscopy）是最簡單且用途最廣的二維實(shí)驗(yàn)。COSY是通過J耦合建立的自旋核與自旋核之間的聯(lián)系，也叫化學(xué)位移相關(guān)譜。同核COSY譜圖中的交叉峰表明了鄰近同核原子之間的耦合。另外，當(dāng)一維譜圖中譜峰重疊或變寬導(dǎo)致譜圖難以解析時(shí)，COSY可以輔助譜峰信號(hào)的歸屬。COSY實(shí)驗(yàn)不僅可以用于觀察¹H-¹H等同核原子之間的相關(guān)性，還可用于關(guān)聯(lián)其他元素的化學(xué)轉(zhuǎn)移。

TOCSY（Total Correlation Spectroscopy）實(shí)驗(yàn)可以提供整個(gè)自旋體系的信息，通過特殊的脈沖序列，實(shí)現(xiàn)從一個(gè)氫核的譜峰出發(fā)，找到與它處于同一耦合體系的所有氫核的相關(guān)峰。TOCSY實(shí)驗(yàn)中，磁化矢量在整個(gè)自旋系統(tǒng)內(nèi)轉(zhuǎn)移，混合時(shí)間的長短決定磁化矢量轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)近；混合時(shí)間越長，磁化矢量傳遞越遠(yuǎn)，而混合時(shí)間很短時(shí)，TOCSY譜相當(dāng)于COSY譜。

二維NOESY（Nuclear Overhauser Enhancements Spectroscopy）實(shí)驗(yàn)主要用于譜峰歸屬、結(jié)構(gòu)的確定、立體構(gòu)型及構(gòu)象的研究。有機(jī)分子中兩個(gè)¹H核（例如H_A和H_B）的空間距離非常相近（通常指3.5?以下）時(shí)，照射H_A至飽和，則H_A信號(hào)消失，而H_B的信號(hào)強(qiáng)度增大，這種現(xiàn)象稱NOE效應(yīng)。是由于空間靠近的核自旋之間的交叉弛豫引起的。NOE的強(qiáng)弱直接與相互作用的原子核間距離有關(guān)，因此NOE在分子結(jié)構(gòu)計(jì)算中往往用于提供原子間距離和空間結(jié)構(gòu)的信息。NOESY實(shí)驗(yàn)經(jīng)常被用來確定一些生物大分子的構(gòu)象，如蛋白質(zhì)，核酸，DNA，RNA等。

原子核在外磁場中的Zeeman分裂所造成的能級(jí)差非常小，處在低能級(jí)的核自旋吸收外加射頻場能量躍遷到離能級(jí)后靠自發(fā)輻射再回到低能級(jí)的效率非常低。因此NMR中核自旋的弛豫主要靠和它周圍偶極子的相互作用。

（5）二維異核NMR實(shí)驗(yàn)

異核相關(guān)實(shí)驗(yàn)中最常用的是¹³C-¹H耦合系統(tǒng)，此外¹⁵N-¹H，²⁹Si-¹H系統(tǒng)也得到廣泛的應(yīng)用。異核二維相關(guān)實(shí)驗(yàn)是直接觀測¹³C、¹⁵N等不靈敏核并獲得它們與¹H之間耦合相關(guān)信息的重要手段。但是因?yàn)?sup>13C、¹⁵N等雜原子的天然豐度低且旋磁比低，NMR信號(hào)非常弱，一維譜采樣便較為困難，二維譜則需要占用更長的時(shí)間，這嚴(yán)重影響了異核二維相關(guān)實(shí)驗(yàn)的廣泛應(yīng)用。

HMQC（Heteronuclear Multiple Quantum Correlation，異核多量子相關(guān)）實(shí)驗(yàn)是通過檢測¹H信號(hào)而達(dá)到間接測¹³C或者¹⁵N信號(hào)的一種方法。對(duì)于濃度很稀的樣品，直接測得一維¹³C譜往往需要十幾個(gè)小時(shí)，而測¹⁵N譜幾乎不可能，可是用HMQC方法測小分子的¹³C-¹H相關(guān)譜圖一般只需要1-2小時(shí)，測¹⁵N-¹H相關(guān)譜圖用大半天也可以取得較好的結(jié)果。不僅如此，而且獲得的結(jié)果是二維相關(guān)譜，從中可以直接獲得異核耦合的信息，大大方便了信號(hào)的歸屬。

HSQC（Heteronuclear Single Quantum Correlation，異核單量子相關(guān)）實(shí)驗(yàn)可以給出直接相連的碳?xì)湎嚓P(guān)信息，而不能解決碳與季碳相連的問題，或隔碳相連的問題。HSQC與HMQC的譜圖相同，都是顯示¹H核和與其直接相連的¹³C核的相關(guān)峰，其作用相應(yīng)于C,H-COSY譜；其中HSQC譜圖中F1維分辨率比HMQC高，但脈沖序列更為復(fù)雜。

HMBC（Heteronuclear Multiple Bond Correlation，異核多重鍵相關(guān)）實(shí)驗(yàn)仍以HMQC實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，脈沖序列由四個(gè)簡單HMQC脈沖序列組成，只不過長程耦合常數(shù)比單鍵耦合常數(shù)小很多而已。相鄰2鍵或者3鍵的¹³C-¹H耦合常數(shù)一般為5-10Hz，實(shí)驗(yàn)中只要按J=7.5Hz設(shè)定為70ms，就可達(dá)到HMQC的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。因此HMBC實(shí)驗(yàn)本質(zhì)上說是借助于較小耦合常數(shù)完成的HMQC實(shí)驗(yàn)，在演化過程中也是多量子相干在起作用。與HMQC譜中一個(gè)¹H峰只能與一個(gè)¹³C峰相關(guān)不同的是，在HMBC中，一個(gè)¹H峰可以與多個(gè)¹³C峰相關(guān)。HMBC實(shí)驗(yàn)主要用于解決四級(jí)碳信號(hào)的問題。

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