鑠思百檢測可提供掃描電鏡測試，制樣服務(wù)。掃描電鏡已經(jīng)成為各個領(lǐng)域研究觀察各種材料的微細(xì)結(jié)構(gòu)和形貌的重要手段，要得到滿意的觀察結(jié)果，除了要熟練掌握儀器操作技術(shù)外，還必須了解樣品的性質(zhì)特點，科學(xué)地掌握樣品的制備技術(shù)。樣品常規(guī)的制備方法包括了以下幾個步驟：取樣、清洗、固定、脫水、干燥、粘樣以及樣品的導(dǎo)電處理。

一、取樣

取樣是采集研究對象的工作，由于應(yīng)用掃電鏡研究材料的種類繁多，對取樣很難作一般的敘述和統(tǒng)一的要求。一個總的原則是取樣工作取決于研究目的。何時取、何處取、取何部位、取多少，完全取決于研究目的。主要考慮以下兩個方面的問題：

（1）注意研究目的對樣品具有針對性，避免盲目取樣

（2）注意研究目的的典型性，即所取樣品應(yīng)該要有研究的具體對象

二、清洗

掃描電鏡主要觀察的是試樣的表面結(jié)構(gòu)，若樣品表面附著粉塵、粘液、蠟質(zhì)、油脂等污染物，就會影響研究結(jié)果的真實性。因此對研究樣品必須進行清洗，清洗時要根據(jù)研究目的和樣品性質(zhì)以及污染物的性質(zhì)選用不同的清洗液和清洗方法。

1）清洗液

常用清洗液有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液等。特殊清洗液有蛋白分解酶、氯仿、二甲苯、加酶緩沖液等。

2）清洗方法

樣品具有抗變形性強的結(jié)構(gòu)，且污染物是附在其表面上或者易溶下水的物質(zhì)可以用蒸餾水換洗、沖洗、流洗或漂洗等；樣品具有抗變形弱的結(jié)構(gòu)，只能用磷酸緩沖液反復(fù)清洗，以求盡量顯現(xiàn)其表面微；表面有蠟質(zhì)的材料，要用氯仿、二甲苯脫蠟處理再清洗；對于表面難清洗的粘液、鹽肪和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的雜質(zhì)，可用加酶緩沖液，石油醚類或不同的蛋白酶處理，使粘液成為能溶于水的物質(zhì)，再反復(fù)水洗。但是，蛋白分解酶對樣品表面微細(xì)結(jié)構(gòu)易造成損傷，因此在處理時必須根據(jù)樣品的性質(zhì)掌握好處理時間和處理濃度；動物臟器表面含有較多粘液，通常把組織塊放在生理鹽水多次沖洗，并隨時在解剖鏡下檢查是否干凈，如果不干凈可用注射器吸溶液多次沖洗，或用酶選擇性消化清洗，或用顯微解剖法除去。昆蟲表面是硬殼的結(jié)構(gòu)，用細(xì)毛筆在生理鹽水中輕輕刷洗數(shù)次，就可以洗去表面附著物；有些細(xì)小的樣品，可利用其比重不同，采用離心機離心清洗，如細(xì)菌、指環(huán)蟲等有的污染物需要用酸成堿腐蝕溶解，然后再用蒸餾水反復(fù)清洗。

三、樣品固定

1）固定的目的與要求

固定就是指采用化學(xué)或物理手段，快速而準(zhǔn)確地(不失真)把研究樣品的結(jié)構(gòu)（包括內(nèi)部結(jié)構(gòu)）或表面形貌依原樣(如生活時的狀態(tài))保存下來。固定的關(guān)鍵就在于“快速”和“準(zhǔn)確”?？焖偈侵冈谘芯康慕M織結(jié)構(gòu)尚未解體和未自溶之前就迅速將其固定下來。準(zhǔn)確是指把所要研究的結(jié)構(gòu)完好的依原樣保存下來。

固定的目的是要盡可能地保存樣品的各種成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)，使研究對象接近活體的狀態(tài)。因此，取好的新鮮樣品要盡快置人固定液中。對固定的要求是能使樣品承受高能電子束的轟擊而不變形。

2）固定劑的選擇

由于任何一種固定劑都有其局限性，因此應(yīng)根據(jù)實驗材料和目的選擇合適的固定劑。在掃描電鏡生物樣品備中，常用的固定劑有俄酸、醛類和高錳酸鉀等。

3）固定液配

制戊二醛固定液的常用濃度為1%~4%，要配置于中性鹽的“緩沖液”之中，不能用醋酸-巴比妥鹽緩沖液，因為固定液和原生質(zhì)液之間如果存在滲透壓的差異有可能引起細(xì)胞器的破裂，加人中性鹽可以增加固定液的濃度，使固定液和組織液保持等滲;而且固定與原生質(zhì)接觸處會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，釋放出氫離子或羥基離子，從而改變組織內(nèi)的pH值，加人中性鹽以吸收這些離子面維持其pH不變，避免由于pH值的變動而導(dǎo)致許多復(fù)化，固定液一定要具有接近樣品生活時織和細(xì)胞中的pH值及滲透壓，以求到樣品的真實形態(tài)和結(jié)構(gòu)，或者說將樣品處理過程中難以避免的變形減輕到最低程度。

4）固定方法

掃描電鏡制樣的固定方法很多，如單固定（戊二酸單固定、鋨酸熏蒸固定）、戊二酸鋨酸雙固定、戊二酸鋨酸微波固定、戊二酸微波固定和甲醛固定等。常用戊二醛-鋨酸雙固定法，它適用于各種材料的固定。對一些較容易固定或不容易變形的材料，從降低實驗成本考慮，可用戊二醛單固定;觀察固體培養(yǎng)基上的真菌菌絲之類的樣品時，可用鋨酸熏蒸固定；對于含水量較多的樣品，常用低溫冷凍固定；此外還有戊二醛微波、皮二醛酸微波FAA、甲醛等固定法。但有些樣品(如干種子、花粉、孢子等)即使不固定，其形態(tài)結(jié)構(gòu)也不會發(fā)生變化，所以可以不固定。

固定是樣品制備中重要的環(huán)節(jié)之一，除了注意固定劑、固定方法的選擇，以及配置固定液的緩沖液、pH值、離子濃度和滲透壓等的選擇因素外，還要注意固定溫度、固定時間、清洗以及固定液浸沒樣品。

四、脫水

脫水的目的是用脫水劑取代樣品中的游離水，以便進行干燥處理。

1）脫水劑

常用脫水劑有乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅酸胺脘、正丁醇等。脫水劑的選擇應(yīng)根據(jù)干燥方法而定。如果采用臨界點干燥，自然干燥、烘干干燥，冷凍干燥、微波干氮氣干燥等干燥方法，均用酒精或內(nèi)酮脫水;如采用真空干燥法，就用叔丁醇，乙睛、正丁醇或六甲基二硅酸胺脘脫水。

2）脫水的原理

用一種低表面張力的有機溶劑(乙醇，叔丁醇等)代換組織細(xì)胞中的游離水，使樣品在十燥時表面張力減少。

3）脫水的要求

在不引起結(jié)構(gòu)的變形的前提下，脫水徹底。

4）脫水方法

采用系列濃度脫水，起始濃度視樣品性質(zhì)不同而定，一般從30 %或50 %開始，有些材料(如甘線蟲等)從10%開始脫水。為了免樣品損傷，應(yīng)采用樣品不移出容器開始，通過棄、加脫水的力法進行換液。若樣品較小，在棄脫水劑時容易丟失樣品，可用擦鏡紙將樣品小心包好。此環(huán)節(jié)在脫水70 %時進行，注意避免人為損傷。

五、干燥

對于含水分的樣品，由于水分蒸發(fā)，樣品就會收縮變形(體積變化，結(jié)構(gòu)皺縮或于裂)，表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)就會被破壞，而且水蒸氣污染物鏡、光闌等重要零部件，并使熒光屏蒙上一層霧，看不見視野。因此樣品在觀察前，必須進行干燥處理。

六、粘樣

粘樣的目的是保證樣品在樣品臺上不移動、不掉落，尤其是作傾斜、旋轉(zhuǎn)觀察時不掉落。此外，用導(dǎo)電膠粘樣，能增加樣品與樣品臺之間的導(dǎo)電性，使樣品上聚集的二次電子能通過導(dǎo)電膠傳輸?shù)綐悠放_上，而不發(fā)生電荷積累。粘貼樣品的材料的選擇取決于所觀測的樣品，比如，粘貼動植物組織塊樣品最好使用導(dǎo)電膠，常用的有銀粉、石粉等導(dǎo)電膠；需要鍍金觀察的樣品通常用雙面膠粘樣；果殼、種子等較大的樣品可以采用普通膠水粘樣，注意待膠水自然干燥后方可裝樣。粘貼樣品必須注意觀察面向上，并且盡可能在水平面的同一高度上，操作時要注意防塵防潮和防止易飛散樣品的相互混雜。

七、樣品的導(dǎo)電處理

為了使研究試樣能在掃描電鏡的真空中穩(wěn)定地觀察表面形貌(有時是內(nèi)部)，并保證圖像質(zhì)量，對非導(dǎo)體的材料在觀察前必須進行導(dǎo)電處理。導(dǎo)電處理的方法很多，常用的方法有金屬鍍膜法(真空蒸發(fā)法和離子濺射法)、導(dǎo)電染色法、電鍍法、陽極氧化法等。在掃描電鏡制樣技術(shù)中用得最多的是金屬鍍膜法和導(dǎo)電染色法，這兩種方法適應(yīng)性廣，對各類材料(包括生物樣品、非金屬、半導(dǎo)體和絕緣體等)均可采用。

金屬鍍膜具有如下效果：

1）樣品鍍膜后易產(chǎn)生大量二次電子，使圖像反差，亮度、分辨率和清晰度都得到改善，從而提高圖像質(zhì)量；

2）鍍膜防止了來自組織內(nèi)部的信息混入到有用的信號中，保證收集到的信號是樣品表面的信號，從而使圖像更真實；

3）金屬膜的機械強度和抗電子轟擊能力都比生物樣品強，所以鍍膜能防止或減輕電子束對樣品的損傷；

4）金屬材料的電阻率比生物材料低，樣品與樣品臺的鍍膜是相連的，這有和次電子的釋放，從而防止或減輕樣品的放電現(xiàn)象。

非導(dǎo)體試樣表面噴鍍一層導(dǎo)電膜，這層導(dǎo)電膜必須符合如下要求：

1）厚度要盡可能均勻；

2）膜本身沒有結(jié)構(gòu)或者是微細(xì)到難以查出的程度；

3）膜要薄，不會掩蓋樣品表面原來的微細(xì)結(jié)構(gòu)；

4）這層膜二次電子的發(fā)生率要多；

5）膜本身不能因為掃描電子束的入射而發(fā)生變化，在大氣中保存樣品不變質(zhì)，在化學(xué)上要穩(wěn)定。

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