生物樣本做透射電鏡觀察方法與要求

二維碼

發(fā)表時(shí)間：2024-04-18 10:51作者：鑠思百檢測(cè)

生物樣本做透射電鏡觀察方法是什么？生物透射電鏡是觀察生物細(xì)胞樣品內(nèi)部形態(tài)的重要工具，廣泛應(yīng)用于組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)、病理學(xué)及材料學(xué)等多個(gè)學(xué)科的研究中。今天鑠思百檢測(cè)小編將詳細(xì)介紹生物透射電鏡的樣品要求、取材流程及要求、注意事項(xiàng)，以及樣本儲(chǔ)存運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)，和部分樣品的結(jié)果展示。

一、生物透射電鏡介紹

生物透射電鏡是觀察生物細(xì)胞樣品內(nèi)部形態(tài)的重要工具，其電壓在80-120kv可以降低生物樣品因高能電子束輻射而損傷的影響，同時(shí)依賴于生物樣品制備技術(shù)的發(fā)展，如超薄切片技術(shù)、負(fù)染色技術(shù)、冷凍制樣技術(shù)、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)等，廣泛應(yīng)用于組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)、病理學(xué)及材料學(xué)等多個(gè)學(xué)科的研究中，一般用來觀察細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞器等亞顯微結(jié)構(gòu)變化、材料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的分布情況或者細(xì)胞應(yīng)付外界刺激產(chǎn)生的自噬小體等結(jié)構(gòu)，以及外界生物入侵的侵染結(jié)構(gòu)等。

二、生物樣品做透射電鏡要求

1. 送樣要求

（1）細(xì)胞樣品用1.5ml的尖底管，離心成團(tuán)（至少黃豆大?。?，加入2.5%戊二醛固定液（固定液加滿離心管，使樣品完全浸沒在固定液中），放置于4°C固定12h后，用泡沫盒加冰袋低溫保存運(yùn)輸，注意：樣本管與冰袋隔開，避免固定液結(jié)冰。（細(xì)菌樣品要求同細(xì)胞）；

（2）組織樣本：腸、血管、皮膚、肌肉等有方向性樣本需切成1mm*3mm*0.5mm長(zhǎng)方體小塊（如下圖B），要觀察的面為橫切面（1mm*0.5mm），使用2mL離心管加滿2.5%戊二醛固定液；無方向性的組織，如肝臟、腎臟、肺臟等可切成1mm3立方體小塊（如下圖A），使用2mL離心管加滿2.5%戊二醛固定液。放置于4°C固定12h后，用泡沫盒加冰袋低溫保存運(yùn)輸。注意：樣本管與冰袋隔開，避免固定液結(jié)冰。

圖1：電鏡樣本的大小和形狀

2. 取樣建議

生物樣品透射電鏡取材注意事項(xiàng)：

取材是電鏡實(shí)驗(yàn)的第一步，其操作成功與否直接關(guān)系到電鏡結(jié)果的效果及成敗。為了得到好的結(jié)果，請(qǐng)務(wù)必按要求做好取材！取材基本要點(diǎn)：快（1min）、冷（4℃）、?。? mm³）、凈（無雜質(zhì)）、準(zhǔn)（部位準(zhǔn)確）。不同的樣品，取材細(xì)節(jié)上有很大區(qū)別！取材部位準(zhǔn)確，且注意觀察組織的方向性和定位。動(dòng)作輕巧，器械鋒利，避免對(duì)組織的擠壓和推拉，建議用鋒利的手術(shù)刀片、手術(shù)剪刀。

（一）動(dòng)物組織取材流程及要求

取材流程：動(dòng)物麻醉或斷頭急性處死，解剖取出所需的器官或組織，生理鹽水簡(jiǎn)單沖洗血液及組織液。按要求將組織切成1mm3左右小塊，固定于組織及細(xì)胞電鏡專用2.5%戊二醛固定液中。

固定方式有兩種：

（1）浸泡固定：適用于一些能允許在短時(shí)間內(nèi)停止供血而仍保持其功能和結(jié)構(gòu)的器官或組織，以及一些病理檢查的樣品。其方法是經(jīng)解剖（或手術(shù)）盡快從機(jī)體中取出所需組織，并按取材要求，把組織切成小塊，放入小瓶子內(nèi)作常規(guī)固定。

（2）血管灌注固定：適用于取材較復(fù)雜或?qū)θ毖踺^敏感的器官或組織，須采用血管灌注固定。灌注固定一般通過供血的動(dòng)脈進(jìn)行，小動(dòng)物也可經(jīng)左心室或升主動(dòng)脈穿刺，行全身灌注?？筛鶕?jù)動(dòng)物的大小選用全身灌注或局部灌注的方式。參考方法：首先用50毫升生理鹽水（37℃）清洗血液，接著用50毫升固定液（37℃）快速灌注固定，然后用250-300毫升冷固定液（4℃）慢速灌入，持續(xù)10-15分鐘后取材，置組織于同樣固定液中，在4℃冰箱中固定，灌注液跟后面的固定液一樣，使用2.5%的戊二醛。

具體取材要求

（1）位置：肝、肺、脾等無需定位組織取1mm3組織，3-5塊；需要定位組織如骨骼肌、腎、腸、血管、胰島等組織取材大小為0.5mm×1mm×3mm左右的長(zhǎng)條狀，且保證觀察結(jié)構(gòu)在組織塊中。

（2）操作：試劑、容器、器械提前4℃預(yù)冷；組織離體后，1min內(nèi)浸入戊二醛固定液。取材時(shí)，可提前準(zhǔn)備一個(gè)載玻片（硬卡紙），滴幾滴戊二醛固定液，把標(biāo)本浸在液滴中修整至合適大小（時(shí)間可稍長(zhǎng)），用牙簽挑出3～5粒標(biāo)本，放入1.5ml尖頭EP管。將修整好的標(biāo)本塊放入戊二醛固定液后，普通4℃冰箱保存。

（二）細(xì)胞取材流程及要求

對(duì)于細(xì)胞、細(xì)菌樣本取材，取好后需放入1.5ml離心管中（尖底），黃豆大或者綠豆大，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)類型不同，取材方式不同。

1、懸浮細(xì)胞：輕微并短暫離心培養(yǎng)液后收集細(xì)胞，加入新鮮緩沖液，低溫1000rpm/min（離心力不可過大，離心時(shí)間不可過長(zhǎng)，避免機(jī)械擠壓導(dǎo)致細(xì)胞變形，也可根據(jù)具體情況調(diào)整）離心5min，棄上清。滴加新鮮緩沖液重懸15min，低溫1000rpm/min，離心5min，棄上清，重復(fù)2遍。敏感的細(xì)胞直接固定，不洗。樣品加入4℃預(yù)冷戊二醛固定液后重懸，4℃固定過夜。

2、貼壁細(xì)胞：采用輕吹，刮刀；若用胰酶消化0.5min后立即加入血清終止（貼壁牢的腫瘤細(xì)胞，可以消化+刮刀），置于尖底1.5mL離心管中，滴加1小滴固定液立即混勻（勿使液體凝固），低溫1000rpm/min離心5-10min，取上清（不清洗），沿管壁小心加滿4℃預(yù)冷固定液，使細(xì)胞成團(tuán)。

3、細(xì)菌：吸取OD0.5-0.8的培養(yǎng)物，離心后棄培養(yǎng)基，收集菌體沉淀于管底黃豆大小，可以用PBS洗1-2次，棄掉上清液，沿管壁緩慢加入4℃預(yù)冷的固定液，然后放入4°C冰箱保存。

4、固體培養(yǎng)：從培養(yǎng)基上刮取細(xì)胞群落，加入新鮮緩沖液，低溫1000rpm/min離心5min后，棄上清。滴加新鮮緩沖液重懸15min，低溫1000rpm/min離心5min，棄上清，重復(fù)2遍。樣品加入戊二醛固定液后重懸，4℃固定過夜。

注意事項(xiàng)

（1）細(xì)胞數(shù)量充足（6cm或10cm皿長(zhǎng)滿），離心后在EP管中黃豆大?。?/span>

（2）緩沖液、戊二醛固定液等PH值7.3-7.4，4℃提前預(yù)冷；

（3）貼壁細(xì)胞連著培養(yǎng)基用細(xì)胞刮斜著快速刮下，不要反復(fù)來回刮；

（4）細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，1000-3000rpm離心成團(tuán)，棄上清，加PBS，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5mL尖頭EP管，再次離心后棄上清。再加PBS重復(fù)上述步驟，最后加2.5%戊二醛固定，4℃保存。操作輕柔，盡量保證細(xì)胞不散開。(轉(zhuǎn)速及時(shí)間請(qǐng)結(jié)合細(xì)胞情況，盡量低轉(zhuǎn)速、短時(shí)間，以細(xì)胞離心成團(tuán)為準(zhǔn)?。≒BS 清洗時(shí)間過長(zhǎng)，易造成細(xì)胞損傷)；

*固定液的量請(qǐng)參考上圖，加至箭頭所示位置

（三）植物組織取材及要求

取材流程：PBS沖洗樣品，確保無泥沙等污染物。然后用鋒利刀片或剪刀將樣品切成合適大小，裝入預(yù)冷的植物及細(xì)菌電鏡專用2.5%戊二醛中。不需要定位的樣品切成1立方毫米大?。ㄈ缛~片、果實(shí)、花粉等），需要定位的樣品，切成1mm×3mm×0.5mm的長(zhǎng)條狀（莖、根、表皮等）隨后抽氣，讓組織能沉淀到管底。

注意事項(xiàng)：植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和液泡會(huì)阻礙固定液迅速滲入。植物材料內(nèi)部存有的空氣，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影響到植物組織的固定效果。組織放入戊二醛固定液后，可用真空泵或者50ml的注射器抽出組織內(nèi)部的氣體或者用濾紙壓住葉片，使材料沉入固定液中。簡(jiǎn)易抽氣方法：將植物組織同固定液一起倒入注射器，用乳膠手套食指堵住注射器出口，右手拉動(dòng)針?biāo)?，將注射器口垂直向上，松開食指，右手輕推針?biāo)ㄊ挂好嫔系臍馀輳淖⑸淦骺谂懦?，反?fù)多次，直至組織沉入固定液。