一、什么是負(fù)染色技術(shù)
負(fù)染色技術(shù)是一種制備電子顯微鏡樣品圖像呈現(xiàn)復(fù)反差的技術(shù)。用于觀察樣品中的顆粒性物質(zhì)或生物大分子。用金屬鹽對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，使整個(gè)載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽，而有凸出顆粒的地方則沒有染料沉積。染色后，在電鏡下觀察時(shí)，被觀察的對(duì)象為亮的，背景為暗的。負(fù)染色是只染背景而不染樣品，與光學(xué)顯微鏡樣品的染色正好相反。目前最常用的負(fù)染液是醋酸鈾或者磷鎢酸。
樣本類型：一般負(fù)染的樣品包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、外泌體、細(xì)菌、病毒及各種有機(jī)聚合物納米材料。
特點(diǎn)：不需經(jīng)過固定、脫水、包埋和超薄切片等復(fù)雜操作，而是直接對(duì)沉降的樣品勻漿懸浮液進(jìn)行染色。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、用量極少、省時(shí)快速及分辨力高。
一、制樣步驟
常用的負(fù)染制樣方法有混合法、懸滴法、漂浮法等，本實(shí)驗(yàn)室常用的是懸滴制樣法，具體制樣流程如下：
1、樣品準(zhǔn)備：首先，將稀釋后的生物樣品滴在載網(wǎng)上，通常是涂布在一個(gè)網(wǎng)格狀的銅或鎳網(wǎng)上的小洞（也稱井）內(nèi)。
2、負(fù)染色劑添加：隨后迅速滴加一種高電子密度的染色劑，如磷鎢酸、醋酸鈾等。這些染料對(duì)電子束有很強(qiáng)的散射作用，在TEM下顯示出明顯的暗色背景。
3、吸附與干燥：染色劑溶液圍繞并滲透進(jìn)入樣品內(nèi)部，但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而是通過物理吸附形成一層包裹樣品的高密度外殼。然后樣品經(jīng)過自然揮發(fā)或加速干燥，使染色劑固定在樣品周圍及可能的部分內(nèi)部空隙中。
4、電鏡觀察：在透射電鏡下觀察時(shí)，由于高電子密度的染色劑形成的背景區(qū)域?qū)﹄娮拥奈栈蛏⑸淠芰^強(qiáng)，因此在圖像上呈現(xiàn)為暗色；而樣品因其較低的電子密度相對(duì)顯得較為透明或亮色，從而與暗色背景形成鮮明對(duì)比，使得樣品的輪廓和形態(tài)特征得以清晰顯現(xiàn)。
三、樣品要求
1.樣本量及寄送要求：
（1）液體樣品提供至少100μl，并配置好合適的濃度（上機(jī)前直接滴加樣品，不做稀釋或濃縮），濃度、純度對(duì)拍攝效果影響比較大；
（2）粉末樣品30mg左右，并注明溶劑類型及配置比例；
（3）外泌體樣品100μL，干冰運(yùn)輸寄送（不少于10kg干冰）；
（4）病毒（滅活）、細(xì)菌樣本，4℃運(yùn)輸寄送；
2.樣品注意運(yùn)輸方式，需要冰袋或者干冰運(yùn)輸?shù)恼?qǐng)?zhí)崆罢f明，并附詳細(xì)送檢要求的預(yù)約單。
3.測(cè)試周期：一般為樣品接收后的1周左右，如遇法定假期需要順延，具體實(shí)驗(yàn)周期及送樣時(shí)間請(qǐng)與e測(cè)試工作人員溝通確認(rèn)，謝謝！
4.交付數(shù)據(jù)：每樣提供8張拍攝圖片（不提供分析服務(wù)）。如需更多照片請(qǐng)?zhí)崆芭ce測(cè)試工作人員溝通確認(rèn)，并且會(huì)產(chǎn)生額外費(fèi)用，請(qǐng)悉知！結(jié)果反饋請(qǐng)?jiān)跍y(cè)試完成一周內(nèi)，不建議回收樣品，如有需要請(qǐng)?zhí)崆胺答伣oe測(cè)試工作人員。
負(fù)染色的效果可能與樣本的運(yùn)輸時(shí)間、濃度、純度有關(guān)，如需負(fù)染色，關(guān)于樣本準(zhǔn)備和測(cè)試安排，請(qǐng)?zhí)崆芭ce測(cè)試工作人員溝通確認(rèn)。
四、結(jié)果展示
1、透射電鏡正染色和負(fù)染色的區(qū)別？
負(fù)染色又稱陰染色，是相對(duì)于普通染色（稱正染色）而言。所謂負(fù)染，是指通過重金屬鹽加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。
在超薄切片的染色中，染色后的樣品結(jié)構(gòu)的電子密度因染色而被加強(qiáng)，在圖像中呈現(xiàn)黑色，而背景因未被染色而呈光亮，這種染色稱為正染色。而在負(fù)染色中則相反，由于染液中某些電子密度高的物質(zhì)(如重金屬鹽等)“包埋”低電子密度的樣品，結(jié)果在圖像中背景是黑暗的，而樣品像“透明”的光亮，兩著之間的反差正好相反，故稱為負(fù)染色。
① 磷鎢酸，一般用雙蒸水配制成10-30g/L的溶液（pH6.4-7.0），常用于病毒、細(xì)菌、納米聚合物等樣品染色。
② 醋酸雙氧鈾，通常用雙蒸水制成2-20g/L的溶液（pH可不調(diào)），常用于蛋白質(zhì)樣品、細(xì)胞外囊泡、脂質(zhì)體等樣品染色。
③ 甲酸鈾，配置成5-20g/L的溶液（pH3.5），常用于蛋白質(zhì)染色。
一般選用300目/400目有膜的載網(wǎng)。
①載網(wǎng)在使用時(shí)需要注意哪一面是有膜面，如果肉眼無法辨別，建議在光鏡下辨認(rèn)。
②碳膜載網(wǎng)通常親水性稍差，建議使用前進(jìn)行親水處理（離子濺射儀、紫外光照射、加0.05%BSA等）。
4、哪些樣品一般需要負(fù)染？
觀察形貌的生物和有機(jī)類，如細(xì)菌、病毒、膠束等。
5、送樣方式？
易變質(zhì)的需要低溫冷藏，病毒、外泌體需要濃縮并冷凍。
