鑠思百檢測

DETECTION OF TECHNICAL SOUSEPAD

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透射電鏡樣品染色方法介紹

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發(fā)表時間：2024-03-12 10:27作者：鑠思百檢測

透射電子顯微鏡的主要功能是可以將物體放大至數(shù)萬倍乃至千萬倍，樣本的細微差別經(jīng)放大后往往會對結(jié)果產(chǎn)生極大地影響，可以說是差之毫厘，謬以千里。因此漂亮的電鏡圖片的獲取與樣本的收集、儲存和染色的每一個環(huán)節(jié)都息息相關(guān)，今天鑠思百檢測小編，主要對染色進行介紹。

首先我們來看兩張圖


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圖1和圖2都是透射電鏡下的外泌體。但是為什么看起來不太一樣呢？這是由于使用不同的染色方法導(dǎo)致的。目前我們常用的染色主要分為正染色和負染色。圖1是正染色，而圖2是負染色。兩種染色方法的比較如下表：

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一、正染色

1）生物組織，細胞及細菌

由于生物樣本主要由碳、氫、氧、氮等輕元素組成，這些元素原子對電子的散射能力很弱，相互之間的差別也很小。尤其生物超薄切片被樹脂所包埋，這些包埋樹脂對電子的散射能力與樣本本身差別很小。因此透射電鏡生物樣本超薄切片觀察時像的反差極弱。為了提高圖像的反差，要對超薄切片進行電子染色。這里所謂的電子染色不同于光學(xué)顯微鏡的染色，它是利用重金屬鹽(如鉛鹽、鈾鹽等)與細胞的某些成分或結(jié)構(gòu)結(jié)合，由于重金屬對電子散射能力很強，可以使那些與其結(jié)合的結(jié)構(gòu)或成分對電子散射能力增強，從而達到提高樣本本身反差的作用。目前最常用的染色液是醋酸雙氧鈾染色液和檸檬酸鉛染色液。醋酸雙氧鈾能增強細胞核內(nèi)物質(zhì)和結(jié)締組織的電子襯度；檸檬酸鉛可以提高細胞膜結(jié)構(gòu)，核糖體，糖原等結(jié)構(gòu)的電子反差。


01、染液的配置

  • 醋酸雙氧鈾染液：常用的鈾染色液為2%~5%飽和醋酸鈾，用50%~70%乙醇或丙酮配制，也可以用雙蒸水配制。

  • 檸檬酸鉛染液配制方法如下：

    雙蒸水          30ml

   硝酸鉛          1.33g

   檸檬酸鈉       1.76g


將以上溶液盛于50ml容量瓶中，劇烈間斷地搖動30min后，加入1mol/L氫氧化鈉8ml，此時乳白色的渾濁液立即變?yōu)闊o色透明溶液，用雙蒸水加至50ml，過濾后備用。該染液的pH為12，可保存數(shù)月。


02、染色操作方法

準(zhǔn)備兩個培養(yǎng)皿，在底部放一塊牙科用蠟板（或用熔化的石蠟做一層蠟板）。


醋酸雙氧鈾染色

①在蠟板上以等間距離滴上醋酸雙氧鈾染液液滴；
②將帶有切片的銅網(wǎng)切片面向下漂浮在染液的液滴上，避光染色30min；
③用鑷子取出染色的銅網(wǎng)，用新鮮的雙蒸水充分清洗銅網(wǎng)；
④再用小濾紙吸去銅網(wǎng)上的水；
⑤放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，防塵自然干燥。


檸檬酸鉛染色

①在另一個放有蠟板的培養(yǎng)皿中，也以等間距滴上鉛染液的液滴（一定在此皿中放適量的固體氫氧化鈉，讓其吸收空氣中的CO2）；
②將染了鈾的銅網(wǎng)切片面向下放入染液的液滴上，染色5~10min；
③用鑷子夾出銅網(wǎng)，雙蒸水充分清洗銅網(wǎng)；
④再用小濾紙吸去網(wǎng)上的水分；放入專用的切片盒內(nèi)，自然干燥后即可觀察。


注意事項

  • 醋酸雙氧鈾染色液有微量放射性，配好的染色液應(yīng)存放在棕色瓶中4℃保存，用過的廢液必須收集起來，集中處理。

  • 檸檬酸鉛染液中的鉛有毒性，鉛容易與CO2反應(yīng)生成沉淀而污染切片，所以鉛染液需現(xiàn)用現(xiàn)配，使用的雙蒸水也要新制備的。

  • 鉛染的過程不能對著銅網(wǎng)呼氣；染色時間不能過長；染色結(jié)束水洗動作要快；一定要在染色的培養(yǎng)皿中加固體氫氧化鈉。


03、相關(guān)例圖

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2）生物囊泡


01、染液的配置


  • 2%甲基纖維素：將196ml蒸餾水加熱至90℃，邊攪拌邊加入4g甲基纖維素，置于冰浴中，攪拌冷卻，直至溶液達到10℃；繼續(xù)在4℃緩慢攪拌過夜，4℃靜置3天；然后用蒸餾水將最終體積調(diào)至200ml；100000g，4℃離心95min；收集上清液，即為2%甲基纖維素染液。

  • 醋酸雙氧鈾（pH4）：稱取2g醋酸雙氧鈾溶于50ml蒸餾水中。（染液置于20mL塑料注射器中，4℃避光保存，可保存4個月。使用前，用0.22μm過濾器過濾鈾酰溶液所需的量）。

  • 草酸鈾酰（pH7）：將4%醋酸雙氧鈾（pH4）與0.15M草酸溶液（0.945g溶于50mL蒸餾水中）以1：1的比例混合。通過滴加25%NH4OH將pH調(diào)節(jié)至7.0，以防止形成不溶性沉淀物。于4℃避光儲存可保持1個月。


02、染色操作方法


取銅網(wǎng)置于一片封口膜上，用移液槍吸取制備好的懸浮液樣本，滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上。要求液滴完全覆蓋住銅網(wǎng)。20min后用濾紙從液滴邊緣吸去多余液體。PBS清洗后將銅網(wǎng)置于1%戊二醛中5min，蒸餾水清洗8次，每次2min。然后滴上草酸鈾酰染液，染色5min，用濾紙吸去染液，再滴上2%甲基纖維素染液，冰浴10min，用濾紙吸去染液，干燥后于電子顯微鏡下觀察。

03、相關(guān)例圖


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二、負染色


負染色是利用高密度的重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸鈾等），把微小的生物標(biāo)本包圍起來，在黑暗的背景上，樣本的微細結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)陰性反差。所以負染色所顯示的電鏡圖像，正好與超薄切片正染色相反，其樣本結(jié)構(gòu)為透明淺色，而背底則為無結(jié)構(gòu)的灰色或黑色。負染色樣本不需經(jīng)過固定、脫水、包埋和超薄切片等操作，而是直接對沉降的樣本勻漿懸浮液進行染色。操作簡便，溶液使用量少，省時快速，分辨力高。


負染色技術(shù)可用于細菌、病毒、蛋白等大分子結(jié)構(gòu)及生物囊泡等研究工作。特別是在病毒性致病因子的超微病理診斷中，廣泛應(yīng)用。


01、染液的配置


常用的有磷鎢酸、磷鎢酸鉀、磷鎢酸鈉、醋酸鈾等。


  • 磷鎢酸或磷鎢酸鹽的配制：可用蒸餾水或磷酸緩沖液配制成0.5% ~ 3%的溶液，染色前應(yīng)用1mol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀將pH調(diào)到6.4 ~ 7.0。

  • 醋酸鈾染液的配制：將醋酸鈾與蒸餾水配制成0.2% ~ 0.5%水溶液，pH為4.5 ~ 5.5。染液需現(xiàn)用現(xiàn)配。



02、染色操作方法


將制備好的懸浮液樣本，用移液槍吸取，滴于銅網(wǎng)上。放置2min后，用濾紙從液滴邊緣吸去多余液體。然后滴上負染液，染色時間2~3min，用濾紙吸去染液，干燥后電子顯微鏡下觀察。也可將樣本懸浮液或負染液滴在干燥的載玻片上，再把銅網(wǎng)漂浮放在懸浮液或負染液的液滴上，放置2~3min后然后用濾紙吸去銅網(wǎng)上的多余液體，自然干燥后即可觀察。


  • 樣本的純度和濃度：如果樣本含有較多雜質(zhì)，會對負染效果產(chǎn)生影響，必要時，樣本需適當(dāng)純化。樣本的濃度要合適，可做不同的稀釋梯度做對比觀察。

  • 樣本的均勻分散性：在進行負染色時，為了提高樣本的均勻分散性，可在樣本中加入牛血清白蛋白、桿菌肽等，例如0.5ml樣本加入0.05%牛血清白蛋白3~4滴。

  • 掌握好染色時機：當(dāng)銅網(wǎng)上的樣本懸液將要干燥而尚未完全干燥時進行染色，效果比較好5。

  • 控制好樣本懸液及染色液的pH：一般應(yīng)使懸浮液呈中性或略偏酸性為宜(pH 6.7 ~ 7.2)。染液要在染色前用1mol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀將pH調(diào)到6.4 ~ 7.05




03、相關(guān)例圖



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-END-

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