激光共聚焦顯微鏡(LSCM)

激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器，是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針。該儀器利用計算機、激光和圖像處理技術(shù)獲得細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化。該儀器作為目前最先進的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器，主要用于觀察活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化、定量分析以及實時定量測定等。

激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，激光掃描共聚焦顯微鏡光路圖采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本焦平面逐點、逐行、逐面快速掃描成像。

掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點，通過控制調(diào)焦深度，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示所觀察表面的立體結(jié)構(gòu)

三、LSCM與熒光顯微鏡的區(qū)別

熒光顯微鏡：當(dāng)成像面較厚，焦面上方下方的干擾信號都會被觀察到，影響實驗結(jié)果，因此熒光顯微鏡只能觀察靜態(tài)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

LSCM：是在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機控制來進行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。可以觀察亞細(xì)胞層次的一些生化變化，是目前最先進的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器。

優(yōu)勢：LSCM比普通熒光顯微鏡獲得更高對比度、高分辨率圖像，同時具有高靈敏度，對檢測樣品無損傷、可靠和優(yōu)良重復(fù)性。LSCM具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r可觀察并可形成清晰的三維圖像等優(yōu)點，能比寬場看到的成像面更薄，更清晰，在較以往更短的采集時間內(nèi)輕松實現(xiàn)超高分辨率更大觀察視野成像。

四、LSCM的應(yīng)用范圍

LSCM應(yīng)用廣泛，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中日益受到重視。一方面可以觀察細(xì)胞或亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)等研究，如檢測蛋白質(zhì)、抗體及其他大分子；檢測細(xì)胞凋亡；細(xì)胞器的觀察和測定（線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體）；檢測細(xì)胞融合；觀測細(xì)胞骨架；檢測細(xì)胞間隙連接通訊；檢測細(xì)胞或組織內(nèi)脂肪；進行細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)等。同時，LSCM還可以進行活體細(xì)胞或組織功能的實時動態(tài)檢測，如測定細(xì)胞內(nèi)鈣變化；測定細(xì)胞PH 變化；檢測膜電位變化；藥物篩選、檢測熒光漂白恢復(fù)等。除此之外，LSCM在交叉學(xué)課中的高分辨率成像，如神經(jīng)科學(xué)、藥理研究、材料研究、化工原料等也廣泛應(yīng)用。

五、LSCM經(jīng)典案例

六、測試注意事項

（一）樣品郵寄

1、細(xì)胞/細(xì)菌/污泥類樣本

    ①細(xì)胞：凍存的細(xì)胞；25平方厘米培養(yǎng)瓶長到70%加滿培養(yǎng)基室溫固定好寄送

    ②細(xì)菌：菌液5000 rpm離心10 min，于1.5 mL離心管中得到綠豆大小沉淀，寄送沉淀。細(xì)菌類需要死活染色/ROS染色的，一般加冰袋泡沫盒4度保存，樣品不和冰袋接觸。

    ③蛋白/多糖類：樣本加冰袋泡沫盒4度保存或者2.5%的戊二醛固定4度保存，樣品不和冰袋接觸。

    ④污泥類：樣本如果太厚，可以進行冷凍切片，具體請和工作人員溝通。

2、植物類樣本

    ① 直接拍攝：樣品長寬不超過20mm，高不超過10mm；或直徑不超過10mm，厚度不超過5mm，一定標(biāo)出測試面。一般加冰袋泡沫盒4度保存，樣品不和冰袋接觸。

     ②制樣后拍攝：可進行簡單冰切及刀切，軟化等。樣本準(zhǔn)備好后加冰袋泡沫盒4度保存，樣品不和冰袋接觸。

3、生物膜類樣本

①金屬/瓷磚/巖石等塊體類：建議長寬高尺寸不超過1 cm，且均要求樣品表面平整，需要標(biāo)出拍攝面（測試面起伏<200um）；

②薄膜類：直徑尺寸不超過2 cm，一般加冰袋泡沫盒4度保存，樣品不和冰袋接觸；

③若在爬片上培養(yǎng)生物膜，可將爬片粘于培養(yǎng)皿底部，充滿培養(yǎng)基，封口膜密封完全，再4度保存。

4、提供清楚激發(fā)/發(fā)射波長，拍攝倍數(shù)等要求信息；若需要染色，需要注明染色劑種類，標(biāo)明染料名稱和拍攝條件（激發(fā)/發(fā)射波長）

   備注：若做細(xì)胞攝取實驗或其他亞細(xì)胞器的定位實驗時，要求樣品自帶熒光。

5、細(xì)胞類樣品直接拍攝，需要封片后常溫避光郵寄。

6、固體類直接拍攝樣品建議長寬不超過20mm，厚度不超過10mm，重量不超過10g，一定標(biāo)出測試面。

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